自Seager(1969)首次报道犬的冷冻精液成功受胎以来，国外学者对犬精液冷冻技术进行了较深入研究(Kosiniak et al,1992; Thomas et al, 1993)，而国内学者主要对德国牧羊犬精液冷冻技术进行了较深入研究（王力波等，1991；刘海军等，1998）。张嘉保等（1994）通过对德国牧羊犬冷冻精子超微结构的研究证明，冷冻使犬精子的质膜、顶体及线粒体最易受到损害。Oettle(1986)也报道了犬精液冷冻保存后精子顶体受到不同程度损害。

    西藏獒犬是我国珍贵特有的“斗犬”，也是很受欢迎的肉用犬，近几年国内学者（王力波等，未发表）对西藏獒犬冷冻精液技术进行了研究，通过人工授精以改良本地犬，提高本地犬的产肉率。有关西藏獒犬精子超微结构的研究国内、外尚无报道，本研究运用透射电镜技术对西藏獒犬精子的超微结构进行了观察，为犬科动物精子生物学和精液冷冻保存技术的深入研究提供基础资料。..

    1 材料和方法..

    1.1 精液来源..

    由哈尔滨特产研究所提供2头份冻精。用tris─柠檬酸─果糖稀释液稀释后，装入0.5ml塑料细管，平衡2h，然后用液氮熏蒸10min，投入液氮，制做成0.5ml细管冻精。冻精细管在41℃水解冻10s，两份精液冻后活力都为0.6，精子密度5×107]ml。将解冻后的精液分别用3%戊二醛溶液固定，然后保存在4℃冰箱中。..

    1.2 透射电镜观察样品的制备..

    将固定的精子悬液于试管中离心5min（4000r/min），弃去上清液，取适量精子团块用琼脂包埋，用0.1mol.. ．.. L.. -1.. 磷酸缓冲液冲洗3次。1%锇酸固定2h。酒精逐级脱水，放入丙酮1次。618包埋。LKB超薄切片机切片，醋酸铀和硝酸铅双染，日立H─600型电镜观察，拍照。..

    2 观察结果..

    2.1 西藏獒犬精子的超微结构..

    电镜下观察，西藏獒犬的精子由头、颈和尾构成。精子头部正面纵切呈卵圆形（见图1），长约4.62μm，宽约3.13μm；矢面纵切呈楔形，宽约0.66μm，顶端尖，尾端粗，核由高电子密度的染色质构成，其形状与头部大致相同，充满了头的大部分，核内未见空泡。核的前端被顶体覆盖，占头部近3/4。顶体的前部较后部略宽厚，称顶体帽（也称核前帽）；顶体内、外膜间呈中电子密度的顶体内容物；顶体后部有一高电子密度的薄层状致密的赤道段（也称赤道板或顶体领），覆盖头部近1/4。头部后端，赤道段紧接下来为核后帽，与细胞质膜紧贴，与染色质之间有一不规则的空隙。头部下端有一向内凹陷的窝，为植入窝（见图3、图4）。..

    颈部位于头与中段之间，这个区域很短，长约0.88μm，直径约0.63μm。内含中心粒和节柱，通过植入窝与头部相连（见图4）。..

    尾部中段前连颈部，后接主段，长约7.9μm，横切面近圆形，直径约0.83μm。中段最主要特征是质膜内层存在线粒体鞘，线粒体呈螺旋状紧密排列在一起，呈香肠形镶嵌连接，大小不尽一致。线粒体螺旋为42～49转（平均为45转）（见图1）。中段横切可见外周线粒体嵌合数2～24个（平均为7个）（见图5）；纵切面可见线粒体横切面呈念珠形排列在长轴两侧，直径约为0.17μm（见图1）。线粒体包裹9束外致密纤维，其中4条略粗大，内侧是9束二联微管，中心是一对中央微管（见图5、图6），形成9+2型微管结构。..

    中段与主段连接处，即线粒体的末端纵切面上可见一类似终环的三角形结构，电子密度较高，使尾部中段与主段呈套管状连接（见图2）。尾部主段开始纤维鞘代替线粒体鞘，从不同横切面可以看出，纤维鞘越向末端越薄；横切面直径越向末端越小，由0.63μm变为0.36μm（平均为0.51μm）。9束外致密纤维的背腹两束在主段前部与纤维鞘贴紧融合，使主段形成了两个不对称的部分，一部分有3束外致密纤维，另一部分有4束外致密纤维，在融合部位纤维鞘相应增粗（见图7）。在主段末端余下的7束外致密纤维变细，消失（见图8）。..

    尾部终段仅见质膜包围9束二联微管和一对中央微管，形成9×2+2微管结构（见图9）。..

    图版说明..

    图1 西藏獒犬精子纵切的透射电镜图像，显示头、颈、尾中段及尾主段一部分，箭头所指为线粒体 ×8000..

    图2 精子尾中段─主段连接部纵切从左到右箭头所指分别为线粒体螺旋，中段─主段连接部致密环，纤维鞘×30000..

    图3 精子头部纵切，顶体肿胀，质膜与顶体外膜分离，变薄，皱褶。顶体外膜囊泡化，从左到右箭头所指分别为质膜、顶体、核×10000..

    图4 精子头部纵切，顶体肿胀，顶体外膜囊泡化且不连续，顶体外部质膜全部脱落。上下箭头所指分别为中心粒和基板×8000..

    图5 尾中段起始部横切，示线粒体（嵌合数为12个），9束致密纤维及9+2型微管构造，箭头所指为外致密纤维×40000..

    图6 尾中段中后部横切，示线粒体（嵌合数4个），9束外致密纤维（其中4束粗大）及9+2型微管构造，箭头所指为线粒体螺旋×400 00..

    图7 尾主段中前部横切，示纤维鞘、7束外致密纤维及9+2型微管构造，箭头所指为纤维鞘×40 000..

    图8 尾主段后部横切，示纤维鞘和9+2型微管构造，箭头所指为9+2型微管构造×40000..

    图9 尾终段横切，示9×2+2微管构造×40000.. 2.2 冷冻复温后西藏獒犬精子超微结构的变化..

    冷冻复温后西藏獒犬精子形态发生了较大变化，表现出不同程度膜结构的改变。一些精子细胞肿胀，质膜变薄，扭曲，呈波浪形改变，皱褶，部分质膜不连续或破损丢失；顶体膨胀，顶体外膜囊泡化或破损。..

    头部膜结构改变分3种类型。第1种：顶体外质膜与顶体外膜分离，质膜扭曲、变薄，但较完整。顶体膨胀，顶体外膜囊泡化或不连续（见图3）。第2种：顶体外质膜溃散，顶体外膜露出，囊泡化或不连续（见图4）。第3种：顶体外膜全部丢失，顶体内容物外漏，仅剩顶体内膜。3种类型膜改变损害最严重的是第2种类型约30%；第1种类型次之，约为20%；第3种类型最少，约占5%～ 10%。约有40%的精子顶体较完整。..

    中段线粒体和外侧的质膜基本没有大的改变。尾部主段和终段质膜膨胀，皱褶。部分精子终段质膜破损，轴丝外露。..

    3 讨论..

    3.1 犬精子的形态结构特点..

    犬精子头部正面呈卵圆形，矢面呈楔形。西藏獒犬精子头部长度（4.62μm）、中段长度（ 7.9μm）略短于德国牧羊犬的头部长度（5.4μm）和中段长度（11.3μm）.. 〔4〕.. ，而西藏獒犬体重大于德国牧羊犬，因此，可能是精子长度与身体质量成反比的关系.. 〔12〕.. 。西藏獒犬中段线粒体为42～49转，略多于德国牧羊犬的40～44转；而人类为15转，牛为70～75转.. 〔5〕.. ，啮齿类为300转，金钱豹约35～39转.. 〔6〕.. ，熊猴43转.. 〔7〕.. ，因此，线粒体转数代表种属的特征尚不够明显。中段横切线粒数嵌合数西藏獒犬为2～24个，高于德国牧羊犬5～10个.. 〔4〕..

    精子尾部轴丝类型，各种动物不尽一致，如涡虫类“9+1”类型，蜘蛛为“9+3”型，蚕为“9+7”型，而犬与其他哺乳类一样，也与火鸡一样.. 〔8〕.. ，为“9+2”型。关于精子终段微管终止形式，在大熊猫为“13+6+1”形式排列.. 〔9〕.. ，熊猴为“12+7+1”形式.. 〔7〕.. ，而西藏獒犬则与金钱豹.. 〔6〕.. 和牛.. 〔5〕.. 相似为“9×2+2”形式。..

    3.2 冷冻复温对犬精子形态结构的损害..

    张嘉保等（1994）指出，德国牧羊犬精子冷冻后，质膜、顶体及线粒体最易受到损害，导致精子失去受精能力或生命力。本研究结果表明，西藏獒犬精子在冷冻复温后质膜和顶体最易受到损害，线粒体受到的损害较小。..

    冷冻复温后西藏獒犬精子质膜肿胀，变薄，皱褶，部分破损、脱落；顶体也膨胀，这些变化提示细胞肿胀是精子形态改变的主要特征。一般认为，引起超微结构改变的主要原因是：细胞内冰晶直接机械性损伤，细胞外冰晶形成引起渗透压改变或挤压作用。细胞膜功能紊乱。细胞外的冰晶形成并随温度下降而增大，细胞发生脱水皱缩，而在复温过程中冰块融化，由于渗透压梯度作用细胞转为肿胀状态〔10〕)，组织膜变化通透性增加。特别在细胞膜破裂后，精子重要的代谢酶漏入精浆内，细胞内糖的无氧、有氧化谢受到的影响或停止，一部分精子在冷冻复温过程中会丧失活力，这种超微结构损伤与酶漏失和精子活力降低存在一致. . 〔11〕.. 。..

    顶体在受精中起着关键作用，本研究将头部膜结构改变分3种类型。其中，第 1种类型所占比例较小，而且对精子受精力影响较小，因为这种类型精子，顶体外质膜还存在，顶体外膜囊泡化或不连续，而顶体反应中最初的变化也是质膜和顶体外膜的融合。第2种类型顶体外质膜的丧失和顶体外膜的囊泡化或不连续使精子活力下降较大或失去运动能力，使精子受精能力受到较大影响，但由于赤道段顶体膜的完整与核膜的紧密相贴，使精子仍具穿透能力，因为顶体素活性可能与顶体内膜及赤道段有关，顶体内的顶体素在受精中能够溶解透明带，有利于精子穿透.. 〔15〕.. 。第3类型，顶体的完全脱落，使精子完全丧失受精力。..

    冷冻复温对中段线粒体的影响较小，精子能量代谢较正常，活动力由此原因下降不明显。..

    从解冻后西藏獒犬较高的活力（0.6）和对冷冻复温后超