采集安徽肥西、庐江、肥东、定远、桐城五个地区(代号为FX、LJ、FD、DY、TC)猪场病料(肺脏)共计49份，经RT．PCR，PRRSV检测均为阳性。 目前对猪多杀性巴氏杆菌病的微生物学诊断常采用病变组织的涂片染色镜检和病原分离、生化反应及动物试验等，若要鉴定荚膜抗原型还需用抗血清甚或单克隆抗体进行血清学试验。在猪多杀性巴氏杆菌病的快速诊断上，常规方法存在着一定的局限性。本试验同时采用了常规方法和PCR技术进行Pm分离鉴定，其结果相一致。由于PCR技术具有快速、简便、特异、灵敏的优点，并且可以进行荚膜抗原型的特异性检测，避免了血清学鉴定的不便，因此在Pm及其血清型的鉴定方面，PCR方法具有实际应用价值。 1．1．2参考菌株 3讨论 取5μ L PCR产物经1％琼脂糖凝胶(含0．5μl/mL溴化乙锭)在80 V电压下电泳40 min，凝胶成像仪上观察、拍照结果。 7株Pm均扩增出大小约1 048 bp大小的的目的条带，属于A型Pm。 2  结果 自2006年入夏以来，我国南方地区许多猪场发生了以高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征的流行性疾病—猪“高热病”，具有高发病率和高死亡率，给养猪业造成了严重的经济损失。为弄清其病因，各地相关学者对此进行了大量的研究，最后证实猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)变异株是本次猪高热病的主要病原。PRRSV感染能严重损害机体的免疫器官，造成免疫抑制，从而继发其他传染病。临床研究发现，PRRSV单独感染引起的病理变化多为间质性肺炎，然而，发生高热病的猪表现的病变情况则较为复杂和严重，表明PRRSV与其他病原体(如猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌等)的继发和混合感染是引致猪“高热病”发生的原因所在。 1．3生化试验 7株分离菌生化试验结果见表2，均与多杀性巴氏杆菌生化特性相符合。 反应体系：总体积25μL，其中10×PCR Buffer 2．5μL，MgCl2(25 mmol/L)1．5μL，Pml、Pm2、PmAl、PmA2(10 pmoL／L)各1 μL，10 mmol／LdNTPs 0．5μL，ddH20 13μL，DNA模板5μL。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸45 S，共35个循环；72℃延伸10min。 1．4细菌DNA模板的制备 金黄色葡萄球菌在生长过程中的代谢产物之一是透明质酸酶，A型Pm的荚膜成分对其敏感，可产生生长抑制现象。将分离鉴定的Pm以10 mm的间隔划线接种到鲜血琼脂培养基，然后以金黄色葡萄球菌垂直划线，37℃培养24 h，观察金黄色葡萄球菌接种线周围Pm是否发生菌落抑制或消失现象。 5％胎牛血清肉汤、普通琼脂、鲜血琼脂等培养基自制；葡萄糖等细菌微量生化反应管以及靛基质、硝酸盐还原试剂盒均购自杭州微生物试剂有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTP、DL2000DNA Marker等购自上海生工生物工程技术有限公司。 根据Townsend等报道合成Pm种与型特异性引物，由上海生工生物工程技术有限公司合成，见表1。 在49份PRRSV检测阳性病料中分离到7株疑似Pm。分离菌在鲜血琼脂培养基上生长良好，初为透明、边缘整齐的露珠样菌落，24 h后为灰白色、圆形、微隆起光滑菌落，不溶血；在麦康凯培养基上不生长，普通琼脂培养基上生长贫瘠。在加5％胎牛血清的肉汤中振荡培养12 h出现浑浊。单个菌落革兰氏染色见阴性小杆菌，5％胎牛血清肉汤培养36～48h后菌液染色可看到荚膜，美蓝染色可见两极浓染。7株分离菌均符合多杀性巴氏杆菌生长特性。 1．2细菌分离培养 1．7金黄色葡萄球菌抑菌试验 1．1试验材料养猪技术