对虾白斑综合征（white spot syndrome，WSS）是由对虾白斑综合征病毒（WSSV）引起的以感染对虾甲壳内侧出现直径为0.5～2 mm大小的白色斑点为主要特征的暴发性传染病。该病感染率和死亡率都极高，给养虾业造成了巨大的经济损失。WSSV具有广泛的宿主范围，在甲壳纲和昆虫纲动物中均有其敏感的宿主，以虾、蟹等十足目类为多。目前，普遍认为WSSV存在水平传播（经口感染或浸泡感染）及垂直传播两种传播途径。近年来，国内外一些学者大量投入WSSV分子水平的研究，鉴于其基因组序列与基因库中已知基因的同源性很低，国际病毒分类委员会已将WSSV确定为一种新的无脊椎动物病毒。WSSV是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，属于Nimaviridae科，�Whispovirus�属。病毒粒子直径约65～70 nm，长约300nm，呈现卵圆形至短杆状，无包涵体，在末端有一尾状延伸，囊膜内包裹杆状的呈垂直螺旋带条纹的核衣壳。

1 基因组结构与功能
1.1 基因组结构
   WSSV基因组为双链环状DNA分子，呈螺旋状，是已知最大的动物DNA病毒。Van等报道WSSV基因组为29 2967 bp（AF369029），基因组中均匀分布有58.9％的A+T含量。在WSSV DNA双链上有4 000多个开放式阅读框（open reading frames, ORFs），其中编码50个以上氨基酸的ORF共有684个，从中选取重叠最少的184个ORFs进行分析，推测WSSV基因中92％的基因信息与这184个ORFs相关。

   WSSV基因组中大部分基因功能都未知，目前，被鉴定的结构蛋白基因至少有18个，其中已确定的囊膜蛋白有5个（VP28,VP26/P22,VP19,VP466及VP281），核衣壳蛋白有3个（VP15,VP24及VP35）。其他约有11个已发现被推测为有功能（被认为与已知基因有类似功能或具有相似性）的功能蛋白基因。WSSV基因组中分布有不同大小的9个重复序列。用REPuter软件对同源序列（homologous regions, hrs）进行分析，发现hrs均包含有3～8个约250 bp的重复单元（repeatunits），WSSV基因组共有53个重复单元。在重复单元中，中间均有一约115 bp的高度保守区域，两侧各有一约70 bp的易变区（易变区Ⅰ和易变区Ⅱ）。
1.2 结构蛋白及其功能  
    WSSV的主要结构蛋白有5个，即囊膜蛋白VP28、VP19、VP26/P22及核衣壳蛋白VP15、VP24。VP28由ORF1所编码，其N�端有一高度疏水的α�螺旋跨膜区域，是位于病毒囊膜的主要抗原蛋白。基因组上编码VP19的为ORF182，VP19的氨基酸序列上有两个跨膜区域，使其固定于病毒囊膜上。位于ORF153上曾被认为是核衣壳蛋白基因的VP26基因，用免疫胶体金技术在透射电镜（TEM）下观察到胶体金颗粒位于病毒粒子的囊膜部位，从而确定VP26/P22为囊膜蛋白。VP15基因位于病毒基因组ORF109，其编码的蛋白是一与核衣壳相连的基本DNA结合蛋白。VP24是ORF31编码的，它也是位于核衣壳上的DNA结合蛋白。以上5个主要的结构蛋白均无糖基化位点，而具有囊膜结构的病毒的某些蛋白常以糖蛋白形式出现，因此推测WSSV囊膜上存在的次要结构蛋白中可能有糖基化位点。

   WSSV的次要结构蛋白已发现有VP281、VP35和VP466,除VP35为核衣壳蛋白外，其余两个均为囊膜蛋白。VP281由ORF1050编码，VP281中存在一细胞黏附序列（RGD三肽序列），提示此囊膜蛋白可能在介导WSSV感染时发挥重要作用；另一次要囊膜蛋白VP466中第338～358个氨基酸残基构成的α�螺旋跨膜区域，可能在介导VP466进入核内进行病毒囊膜装配过程中发挥一定的作用。

1.3 功能蛋白基因 
   WSSV功能蛋白基因的研究主要基于核酸序列的同源性比较。WSSV全基因组序列分析发现，该病毒只有6％的基因与已知基因有同源性。已经报道的预测的功能基因有胸腺核苷激酶和胸腺核苷酸激酶（TK�TMK）基因，DNA聚合酶基因，核糖核酸还原酶RR1和RR2基因，蛋白激酶（PK）基因，胸苷酸合成酶（TSY）基因，核酸内切酶（endonuclease）基因，dUTP酶（dUTPase）基因，TATA box结合蛋白（TBP）基因，胶原样蛋白（collagen�like protein，CLP）基因，细胞因子受体基因及1197基因。

    报道的大部分WSSV功能蛋白基因还有待于对其表达产物的功能研究。核糖核苷酸还原酶（RR）由大亚基（RR1）和小亚基（RR2）两个亚单位组成，对感染WSSV对虾的血细胞用共焦激光扫描显微镜进行免疫细胞化学分析，显示RR1、RR2主要集中在细胞核外周，说明RR可能参与WSSV的感染过程；ORF220基因编码的氨基酸序列中含有细胞因子受体gp130家族的特征序列，可能在病毒侵入宿主、抵御和逃避宿主免疫系统的过程中起着重要作用。

2 感染的分子机制

  已有研究证据表明，对虾免疫系统不仅存在非特异性免疫，而且对WSSV也存在一定的特异性免疫应答。尽管对WSSV感染引起的免疫反应分子机制研究甚少，但目前已有报道WSSV主要抗原蛋白可能在感染过程中的作用。Van等通过用WSSV VP28抗血清对斑节对虾（�Penaeus monodon�）的体内中和试验表明，囊膜蛋白VP28对机体具有免疫保护性，推测可能是由于VP28阻断了病毒与宿主细胞受体的结合，从而抑制病毒囊膜与细胞膜的融合；而Witteveldt等实验显示VP28的免疫保护力可达3周，提示VP28可能在WSSV感染后还诱导产生类血清中和因子。由于对虾传代细胞系还未建立，WSSV细胞内复制与增殖的研究进展缓慢。最近Minoru等报道从日本对虾�（Marsupenaeus japonicus）�卵巢组织原代培养中观察到WSSV感染引起的显著细胞病变（CPE），电镜观察显示WSSV的复制过程位于卵巢细胞的细胞核内，但在病毒感染早期并不产生细胞凋亡信号。WSSV感染的分子机制尚不完全清楚，今后的研究也可从病毒受体（virus receptor）着手，运用噬菌体呈现技术（phage display technique）或VOPBA（virus overlay protein binding assay）等方法探讨病毒感染初期与宿主细胞表面受体作用的机制，从而为阻断病毒感染的药物设计提供理论依据。�

3 分子生物学诊断

    目前，对WSS的诊断可根据对虾典型症状（甲壳下出现白斑等）、病理组织学变化、病毒分离鉴定、ELISA等方法进行综合诊断；而分子生物学诊断方法主要有核酸探针杂交技术和聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）技术等。

   近几年新建立的改进PCR检测方法更快速、特异、灵敏，且更具实用性与多功能性。有研究者用巢式PCR（nested�PCR）扩增出WSSV DNA大小不同的片段，能检测出对虾感染WSSV的不同严重程度。Kono等用实时LAMP（loop�mediated isothermal amplification）法检测WSSV在虾体内心脏、胃、淋巴器官的感染过程，该法具有高特异性和高灵敏度。随着分子生物学诊断技术的不断发展，对于WSSV的检测将会进一步完善。�

4 重组疫苗的研究  

  由于对甲壳动物免疫系统的研究起步较晚（认为只存在可能的类免疫应答），目前关于其是否确有特异性免疫反应有待于进一步的研究，因此“疫苗”的提法暂且在本文中为了便于理解而使用。实践证明，用于预防WSS的灭活苗、免疫增强剂等效果均不理想，为此各国学者正致力于研制效果可靠的WSSV基因工程疫苗。基于对虾具可获得性免疫能力的研究， Witteveldt等克隆了WSSV VP28和VP19基因，并将这两个基因分别在Eco.li中进行了高效表达，攻毒试验表明VP28口服亚单位疫苗可产生显著的保护性；由于VP28基因工程疫苗的保护力较持久，推测其可能的作用机理为通过诱导产生类血清中和因子来阻断病毒的侵入和扩散。Namikoshi等实验表明日本对虾�（Penaeus japonicus）�在注射VP26和VP28重组疫苗30天后，其相对存活率分别高达60％和95％，说明两种疫苗均能诱导产生显著的免疫保护力。�

   有关WSSV口服重组疫苗的研究刚刚起步，今后还需开展更深入细致的研究工作。在选择合适的表达系统的同时，还应考虑提高免疫原的表达量以达到有效免疫效果，以及解决口服免疫耐受性等问题。�

5 展望

  尽管WSSV的分子生物学研究取得了较大的进展，但目前还存在许多尚未解决的问题。对WSSV本身的基本特性和功能基因还有待进一步研究和发现；对病毒的感染机制在分子水平上的研究甚少，也是今后研究的重点之一；用于预防WSS的基因工程疫苗也需要进一步研制以及评价其免疫原性。目前，我们课题组利用家蚕杆状病毒表达系统已成功表达了WSSV主要囊膜蛋白，并通过口服免疫中国对虾研究其免疫效果取得了初步进展（待发表），今后将不断完善以增强免疫效果并探讨WSSV感染初期的分子机制。此外，笔者认为还可通过特定载体将表达某种核酶的基因导入虾体并特异性切割病毒的核酸或者将病毒外膜蛋白或核衣壳蛋白的反义RNA基因导入虾体，使之转录反义RNA并与病毒外膜蛋白的mRNA结合，阻止mRNA翻译成病毒外膜蛋白等方法以抑制WSSV的复制和增殖，从而达到防病效果。