摘要：针对目前饲用复合酶制剂活力检测方法问题，本实验选择了还原糖法，并根据动物肠道内环境等实际情况，选择了测定温度40℃、PH4.6,反应时间为30分钟,其中酸性蛋白酶的测定选择PH3.0的条件.
关键词:饲用复合酶制剂 酶活力 反应条件 测定方法
饲用复合酶制剂大多为多菌混合固体发酵制得，其功能因子为水解酶，包括纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶、β——葡聚糖酶、甘露聚糖酶等多种酶。
目前，国内外文献及各酶制剂公司提供的用于测定酶活力的方法很多，如还原糖法、粘度法、色原底物法和放射琼脂扩散法等。还原糖法是测量一种酶在其特定基质上“切断”的数目，该方法已被证明比较准确并且可再复制，是常被使用的一种方法；粘度法的原理在本质上是相同的，但偏向那些可切断基质中间位置的酶，该方法非常费时而且比较复杂；其它方法重复性差，费时，操作复杂，反应颜色不稳定，而且单位难以换算成酶活力单位。
本方法在大量试验的基础上，选择了反应颜色稳定性好，操作简单的还原糖法。其中，酸性蛋白酶的测定采用通用方法——分光光度法。
酶活力的试验方法涉及到酶活力的定义、底物、测定温度、PH值、反应时间、测定方法等多种因素。为使试验结果能相互比较，本方法对酶活力的定义、底物等各种因素分别进行了规定。在对饲用复合酶制剂的研究中，根据各种酶的特性，结合实际情况，确定了酶活力试验的最适反应温度、PH值、反应时间。
1.技术要求
1.1 外观：本品为黄褐色粉状物、无结块、无潮解现象。
1.2 气味；发酵香味、无异味。
2.试验方法
2.1 外观与气味：取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测判定及辨味。
2.2 纤维素酶活力测定。
2.2.1 定义：在40℃、PH4.6条件下，1分钟分解羧甲基纤维素钠产生相当于1ug同葡萄糖的还原糖量所需的酶量，规定为一个酶活力单位，以u/g表示。
2.2.2 原理：纤维素酶从羧甲基纤维素钠中分解出还原糖，还原糖又同3.5—二硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，可用分光光度计测定其色度，计算酶活力。
2.2.3 试剂和溶液
2.2.3.1 0.1mol/1醋酸——醋酸钠缓冲液（PH4.6）；
称取结晶醋酸钠（CH3COONa）13.61g,醋酸（CH3COOH）（浓度99.5%以上）6.00g.用蒸馏水溶解，并定容至1000ml.
2.2.3.2 3,5—二硝基水杨酸试剂（又称DNS试剂）：
称取酒石酸钾钠182.0g，溶解于500ml蒸馏水中，加热（不超过50℃） ，于热溶液中依次加入3,5二硝基水杨酸6.3g,氢氧化钠21.0g,苯酚5.0g,无水硫酸钠5.0g,搅拌均匀至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10天后使用。
2.2.3.3 20.00mg/ml羧甲基纤维素钠溶液
称取2.000g羧甲基纤维素钠，(sigma公司生产）准确至0.001g,用缓冲液（4.2.3.1）溶解，并定容到100ml.
2.2.3.4 1mg/ml 葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600mm汞柱下干燥5小时至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml冰箱保存备用。
2.2.4 仪器、设备
分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。
2.2.5试验步骤
2.2.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制:分别取1mg/ml 葡萄糖标准液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml依次加入7支25ml的比色试管中，以蒸馏水补加到2.0ml,再加入DNS试剂1.5ml,在沸水中煮沸5min,流水冷却,加蒸馏水21.5ml摇匀,在540nm处进行比色测定,用空白管溶液调零点,记录吸光度值,以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线.
2.2.5.2 待测酶液的制备:
称取酶粉1.0g,先用少量的0.1mol/L,PH4.6的醋酸—醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣碎,将上层清液倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再用少量上述缓冲液溶解，如此反复捣研3—4次，最后全部移入溶量瓶中，用缓冲溶液定溶至刻度,用脱脂棉过滤,滤液供测定用.
2.2.5.3 测定
于25ml比色管中加入1ml适当稀释的酶液,在40℃水浴锅中预热5min后加1.00ml羧甲基纤维素钠溶液(2.2.3.3),计时,置40℃水浴保温30min后立即加入1.5mlDNS试剂终止反应,再置沸水中煮沸5min,流水冷却,加蒸馏水至25ml摇匀,以煮沸5min灭火酶液加1.00ml底物溶液(2.2.3.3)同上操作为空白.按照做标准曲线时同样的操作测定光密度值(0.D.),用回归方程计算出相应的葡萄糖含量.
2.2.6 计算
W× n× 1000
X=-------------
T × M
式中 X-----酶活力单位,u/g.
W——用回归方程计算出的相当的葡萄糖mg数；
n——酶液稀释总倍数；
T——反应时间（30min)；
M——样品重量，g.
1000——将毫克换算成微克的换算系数。
2.2.7结果的允许偏差
平行试验相对 偏差不得超过3%，否则重新测定。
2.3半纤维素酶活力测定
2.3.1定义：在40℃、PH4.6条件下,1h分解木聚糖生成1mg木糖所需的酶量,规定为1个酶活力单位以u/g表示.。
2.3.3试剂和溶液。
2.3.3.1 0.1ml/L醋酸—醋酸钠缓冲液（PH4.6）配制方法同2.2.3.1。
2.3.3.2 DNS试剂，配制方法同2.2.3.2
2.3.3.3 20.00mg/ml木聚糖溶液:
准确称取2.000g 木聚糖(sigma公司生产） ,先用适量的缓冲液(2.3.3.1)溶解,在沸水浴中加热,使其完全溶解,冷却后移入100ml容量瓶,用上述缓冲液定容至100ml。
2.3.3.4 1mg/ml木糖标准液:
准确称取100mg分析纯木糖(预先在70℃、600mm汞柱下干燥5小时至恒重)，用少时蒸馏水溶解，定溶至100ml，冰箱保存。
2.3.4仪器、设备同2.2.4。
2.3.5试验步聚。
2.3.5.1木糖标准曲线的绘制.
以木糖代替葡萄糖,其余操作同2.2.5.1葡萄糖标准曲线的绘制步骤。
2.3.5.2待测酶液制备同2.2.5.2
2.3.5.3测定
以木聚糖溶液(2.3.3.3)代替羧甲基纤维素钠于比色管中,40℃保温,30min，DNS试剂终止反应，以灭活酶液加1ml底物溶液（2.3.3.3）反应30min作对照,按标准曲线的操作测定分光光度值,用回归方程计算出相应的木糖含量.
2.3.6计算
W×n
X=----------
T×M
式中 X—酶活力单位，u/g;
W—用回归方程计算出的相当的木糖mg数；
n—酶液稀释总倍数；
T—反应时间（0.5h)
M—样品的重量，g.
2.3.7结果的允许偏差
平等试验相对偏差不得超过3%,否则重新进行测定.
2.4果胶酶活力测定
2.4.1定义:在40℃条件下,1h分解果胶生成1mg半乳糖醛酸所需的酶时规定为1个酶活力单位,以u/g表示.
2.4.2原理:果胶酶在一定的条件下水解果胶,生成半乳糖醛酸,此产物具有还原性醛基可与DNS发生成色反应,可用分光光度计测定其色度,计算酶活力.
2.4.3 试剂和溶液
2.4.3.1 0.1mol/L醋酸—醋数钠缓冲液（PH4.6）:
配制方法同2.2.3.1。
2.4.3.2 DNS试剂：配制方法同2.2.3.2。
2.4.3.3 20mg/ml果胶溶液:称取2.000g果胶(sigma公司生产）,先用适量温热的缓冲液(2.4.3.1)浸泡,然后在沸水浴中加热完全溶解,冷却后用上述缓冲液定溶至100ml。
2.4.3.4 1mg/ml半乳糖醛酸标准液:称取100mg分析纯半乳糖醛酸(预先在70℃、600mm汞柱下干燥5小时至恒重)，用少量蒸馏水溶解，定溶至100ml，冰箱保存备用。
2.4.4 仪器、设备，同2.2.4。
2.4.5试验步骤;
2.4.5.1半乳糖醛酸标准曲线的绘制
以半乳糖醛酸标准液代葡萄标准液,其余操作同2.4.5.1。
2.4.5.2待测酶液的制备:同2.2.5.1。
2.4.5.3测定
1ml适当稀释酶液加 1ml 20mg/ml果胶溶液,40℃水浴保温30min,加DNS试剂终止反应;以灭活酶液加1 ml底物溶液(2.4.3.3)反应30min作对照,按制作标准曲线时同样的操作测定吸光光度值,用回归方程计算出相应的半乳糖醛酸含量。
2.4.6计算
W×n
X=-----------
T×M
式中X—酶活力单位。U/g；
W—回归方程计算出的相当的半乳糖醛酸mg数；
n—酶液稀释总倍
T—反应时间（0.5h）
M—样品的重量，g
2.4.7结果的允许偏差
平行试验相对偏差不得超过3%,否则重新进行测定。
2.5淀粉酶活力测定
2.5.1定义:在于40℃的条件下,1h水解淀粉生成1mg葡萄糖所需的酶量,规定为1个酶活力单位,以u/g表示.
2.5.2原理:淀粉酶具有催化淀粉水解的能力,从淀粉链的非还原性末端开始,分解α—1,4糖苷键,生成葡萄糖,产物与DNS试剂 发生反应,产生一种黄橙混合色,可用分光光度计测定其色度,计算其酶活力.
2.5.3试剂和溶液
2.5.3.1 0.1mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液:配制方法同2.2.3.1。
2.5.3.2 DNS试剂:配制方法同2.2.3.2.
2.5.3.3 20mg/ml可溶性淀粉液:称取2.0000g可溶性淀粉,先用少量缓冲溶解后,徐徐倾入已煮沸的缓冲液中,继续煮沸至透
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