夏利宁1,陶刚2,王凤英1,王金泉1,燕顺生3,赵红琼1,姚刚1

(1.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐　830052;2.新疆焉耆县兽医站　焉耆　841100;3.新疆疾病控制中心,乌鲁木齐　830000)

断奶期为幼年哺乳动物生长发育过程中关键期之一。由于幼畜母原抗体水平低下而主动免疫功能尚未建立健全;母乳停止,生长因子消失,加之摄入固体饲料的能量、蛋白水平不足,以及由于分群等环境因素的影响常出现断奶动物生长抑制(ｇｒｏｗｔｈｃｈｅｃｋ)、断奶后腹泻、死亡率上升等断奶综合症[1]现象。生长抑制及断奶后腹泻的病因学尚无确切定论,目前认为主要是因为上述的多种因子共同作用所致。为了缓解由幼畜早期断奶综合症给养殖业带来了严重的经济损失,人们利用饲料添加剂积极防治幼畜的断奶综合症,在不同程度上有利于养殖业的发展。

    α 酮戊二酸(α ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ,ＡＫＧ)是谷氨酰胺(Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ,Ｇｌｎ)的前体物,因它在溶液中很稳定,且在体内可迅速转化为Ｇｌｎ,发挥Ｇｌｎ的作用,从而成为Ｇｌｎ的替代物应用于生产实践。此外,ＡＫＧ作为饲料添加剂,可通过有效地促进氮的代谢机制,从而减轻动物生产过程中的代谢应激[2],还能保护日粮氨基酸经肠道作为能量被利用。现代药理学分析表明,中草药添加剂具有防病和提高生产性能的双重作用[3]。

    改进型921合剂是在具有良好治疗效果的经验方上,添加具有增强免疫和促进消化的中草药加工而成,但其成分复杂,见效慢[4]。而断奶综合症多发生于断奶早期,所以利用ＡＫＧ见效快的优点,把中草药和ＡＫＧ配合在一起,研制生产出中草药复合添加剂,应用于饲料工业中,期望提高配合饲料质量和饲养效果。因此,本研究通过中草药结合ＡＫＧ作为饲料添加剂饲喂断奶大鼠研究其对幼畜肠道免疫的影响,来进一步揭示其对幼畜黏膜免疫系统的作用机理。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　复方中草药添加剂

     以新疆农业大学动物医学院王正党教授研制的921合剂为基本方组成本实验配方(主要成分为板蓝根、金银花、黄芪、肉桂、地榆、黄连、甘草、神曲等10多味中草药),置80℃烘箱中烘干、粉碎备用,中草药购自乌鲁木齐市药材公司。

1.1.2　有机酸

     α 酮戊二酸(α ｋａｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ,ＡＫＧ)由波兰科学院动物营养与生理研究所Ｚａｂｉｅｌｓｋｉ教授惠赠。

1.1.3　颗粒饲料的加工过程

     大鼠采食的饲料原料均由新疆疾病控制中心实验动物研究所提供,首先将备用中草药按需要量称重、将煎制好的中药连药渣一起混于饲料原料当中,混匀后制粒,凉干后即食。中草药结合ＡＫＧ料制法同上,ＡＫＧ以0.1%的量添加。颗粒饲料的加工由本实验室的成员完成。

1.2　实验动物

     18日龄断奶纯系健康大白鼠30只,雌雄不限,体重40.0±5.0ｇ,由新疆疾病控制中心实验动物研究所提供。

1.3　试验程序

1.3.1　分组设计

     根据随机分组的方法将大鼠称重后分为3组,即:对照组(Ｃ)、中药组(Ｉ)、中药加ＡＫＧ组(ＩＩ)。对照组(Ｃ)每日每鼠自由采食自制大鼠料,中药组(Ｉ)每日每鼠自由采食添加量为4%自制中草药大鼠料,中药加ＡＫＧ组(ＩＩ)每日每鼠自由采食添加量为4%自制中草药结合0.1%ＡＫＧ大鼠料。

1.3.2　饲养试验

     实验动物采用单笼饲养,自由采食,每日称料,每两天称体重一次,试验期分别为1周、2周,分别在第7日、第14日晚禁食,第8日,第15日清晨采用超剂量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠。

1.4　方法

1.4.1　形态学指标

     动物随机分为3组,每组10只,处死前禁食一夜,次日将小肠自幽门剪断,并沿肠系膜将小肠分离至回盲韧带处剪断。将该段在自然状态下分为三段,分别计数肠上皮淋巴集结,并取每段最大的淋巴集结置包因氏液中固定,石蜡切片、苏木紫伊红染色,制成组织切片,用Ｍｏｔｉｃ显微图象处理系统(ａｄｖａｎｃｅ3.0软件)测量横截面积。

1.4.2　肠液中ＩｇＡ的测定

     动物分组同上,处死前禁食一夜,次日剖开腹腔,自幽门处结扎,小心剪开肠系膜,将十二指肠分离出,使其在自然状态下,距幽门8ｃｍ处结扎,取下两头结扎部分,将1ｍｌ灭菌生理盐水注入,将稀释后的肠液吸出,放入1.5ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。用免疫球蛋白Ａ试剂(ＩｇＡ长征体外诊断试剂,上海复星长征医学科学有限公司ＲＥＡＧＥＮＴＴｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉＣＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ)检测ＩｇＡ含量。在温度37℃,用意大利产ＢＴ 224型生化分析仪在340ｎｍ处,测其吸光度值。

1.5　数据处理

     使用统计学软件(ＳＰＳＳｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ11.0)对三组间数据进行单因子方差分析(ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯＶＡ),差异显著性分析采用ＰｏｓｔＨｏｃ法。

2　结果

2.1　肠上皮淋巴集结个数测定饲喂1周、2周后,测定3组间小鼠前、中、后及全段肠上皮淋巴集结个数(表1)。

     由表1可知,饲喂1周后对照组、中草药组及中草药+ＡＫＧ组三组间前、中、后及全段小肠上皮淋巴集结数量变化差异均不显著(Ｐ>0.05)。饲喂2周后:对照组、中草药组及中草药+ＡＫＧ组三组间前、中、后及全段小肠上皮淋巴集结数量变化差异均不显著(Ｐ>0.05)。

2.2　肠上皮淋巴集结面积测定

     饲喂2周后,三组间小鼠前、中、后各段肠上皮淋巴集结面积测定(表2)。由表2可知,饲喂2周后:中草药组及中草药+ＡＫＧ组前、中、后各段小肠上皮淋巴集结面积均大于对照组,且差异极显著(Ｐ<0.01)。采用ＬＳＤ差异显著性分析法可知,在中段中草药+ＡＫＧ组小肠上皮淋巴集结面积大于中草药组,且差异显著(Ｐ<0.05)。

2.3　小鼠十二指肠中ＩｇＡ含量测定

     小鼠分别饲喂1周及2周后,测定十二指肠中ＩｇＡ含量(表3)饲喂1周后,对照组与中草药组肠液中ＩｇＡ含量差异不显著(Ｐ>0.05);中草药+ＡＫＧ组肠液中ＩｇＡ含量显著高于对照组,且差异极显著(Ｐ<0.01);中草药组与中草药+ＡＫＧ组肠液中ＩｇＡ含量差异不显著(Ｐ=0.05)。饲喂2周后:中草药组肠液中ＩｇＡ含量高于对照组,且差异极显著(Ｐ<0.01);中草药+ＡＫＧ组间肠液中ＩｇＡ含量高于对照组,且差异极显著(Ｐ<0.01);中草药+ＡＫＧ组肠液中ＩｇＡ含量高于中草药组,且差异显著(Ｐ<0.05)(表3)。

3　分析与讨论

3.1　对小肠上皮淋巴集结个数的影响

     ＰＰ结是哺乳动物最常见实验系统中主要的感应位点,有利于抗原的摄取、加工和呈递产生黏膜免疫应答[5]。而本实验结果发现无论是饲喂1周还是2周,对照组、中草药组及中草药+ＡＫＧ组各段及全段的肠上皮淋巴集结个数的差异均不显著。这与抗原的刺激是ＰＰ结发育完善所必须的,但并非与其最初形成有关[6]的观点一致。表明小肠上皮淋巴集结个数不是由后天所决定的,而可能与遗传有关,对于此,还有待于进一步研究。

3.2　对小肠上皮淋巴集结面积的影响

     在比较饲喂2周后各段最大肠上皮淋巴集结横切面积时发现对照组在各段面积上均小于中草药组和中草药+ＡＫＧ组,且差异极显著,而中草药组在中段淋巴集结横切面积小于中草药+ＡＫＧ组,且差异显著。本研究表明添加中草药及中草药+ＡＫＧ均能通过增加肠道ＰＰ结的面积,从而改善肠道免疫。中草药+ＡＫＧ组在小肠中段肠道ＰＰ结的面积大于中草药组,且差异显著。这可能与小肠中段的吸收能力有关。

     ＡＫＧ具有谷氨酰胺碳架,是克雷布氏循环的中间体。它可以转氨形成谷氨酸,能进一步氨基化来形成谷氨酰胺,这种转变是迅速的。即ＡＫＧ和谷氨酰胺一样可为肠上皮细胞和免疫细胞供能和补充氮源,同时保障肠道的完整性(屏障功能)和正常的吸收功能[7]。

     中草药兼有营养和药用价值,具有多种营养成分和生物活性物质。其中多糖可能对肠道粘膜免疫具有改善作用[8]。中草药和ＡＫＧ的有机结合可发挥双方的优点,迅速有效的完善肠道免疫系统的生长和发育。

3.3　对十二指肠ＩｇＡ分泌的影响

     本研究发现添加中草药及中草药+ＡＫＧ均能增加ＩｇＡ的分泌来维持肠道黏膜免疫。中草药+ＡＫＧ在饲喂1周后就可极显著的提高肠液中ＩｇＡ的含量,而单纯添加中草药在饲喂到第2周后,肠液中ＩｇＡ的含量才高于对照组,且差异极显著。在饲喂不同时间后对肠液中ＩｇＡ的含量的测定发现,肠液中ＩｇＡ的含量随饲喂时间的增长而呈现下降趋势,对照组2周时的含量不到1周的1/3,虽然中草药及中草药+ＡＫＧ组ＩｇＡ的含量也呈下降趋势,但其下降缓慢,使其浓度相对维持在较高的水平。这也许是中草药及中草药+ＡＫＧ增加肠道派伊尔氏结(Ｐｅｙｅｒ’ｓｐａｔｃｈ,ＰＰ)的面积,间接促进肠道ＩｇＡ的分泌,增强了黏膜免疫功能。此外,从饲喂时间上也反映了中草药虽有效但见效慢的特点和ＡＫＧ可迅速发挥作用的特点,二者结合可取长补短。熊爱兵等发现早期口服中药加味四君子汤能明显维持肠粘膜细胞分泌Ｓ Ｉ