杨秀芹，刘，祖延涛(东北农业大学动物科技学院，哈尔滨   150030)
   
    分子生物学技术的迅速发展为营养科学探索必需营养缺陷的分子基础提供了强有力的实验工具。本文旨在对几种PCR技术和基因剔除技术的原理及其在营养研究中的应用作一综述。

1  PCR差异显示技术
  
    PCR差异显示技术是Liang和Pardee在1992年建立起来的，该方法是建立在RT－PCR的基础上，通过巧妙的引物设计和测序胶电泳来显示细胞中各种mRNA，从而比较同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，为分析生物的生命活动过程提供重要的信息。由于该技术具有快速，灵敏，简单和可用于分析低丰度的mRNA的优点，所以，它一经产生就受到各学科研究者的重视，很快成为克隆新基因和基因表达的有力工具。
  
    PCR差异显示技术利用真核生物的mRNA几乎都具有3′端poly（A）及邻近的二个碱基相应地设计3′端引物T11MN（其中M为G，A或C，N为A，G，C或T），共计12种组合。而5′端有20条随机引物，每个引物由10个碱基组成。计算机分析表明，这种组合从统计学上几乎能覆盖所有的mRNA序列，可以保证差异表达的基因全部被筛选出来。实践证明，这种方法有效，但繁琐，假阳性高，重复性差，而且后续处理也比较复杂。针对这些缺点，近几年出现了较大的改进：包括引物的简化、Tm值的升高，循环参数的优化等，使该技术日趋完美，成为分子生物学强有力的工具。
  
    应用这种新技术，人们能够成功地得到一套包含细胞中所有mRNA的DNA片段，比较出不同细胞类型的片段差异。其它学科的学者及时看到了差异显示技术的使用价值。很快，这种方法被应用于评价现黄酸和生长因子对细胞的影响，以及研究细胞分化、成熟和衰老的分子机制。营养学家们也开始应用这项技术来研究由于营养摄入和营养环境不同所造成的分子水平的变化。由于差异显示技术能够扩增一个细胞中所有的mRNA，故该技术还可用来发现新的mRNA。由于某种营养成分缺失而处于紧张状态的细胞，能够自发地产生缓解这种紧张状态的基因。通过差异显示技术比较"紧张"的细胞与"非紧张"的细胞能揭示由于缺陷出现或消失的mRNA。最近，Levenson和Shay分离、克隆和测序了一种mRNA在铜缺陷小鼠的肝脏中增加了两倍cDNA被扩增测序后发现其与数据库中已知的任何基因都没有相之处。由此研究者们得出结论：他们分离出了一个新的、编码铜调节蛋白的基因。Wang用缺乏铜的日粮饲喂小鼠6周后用差异显示技术分析发现，与正常饲喂铜的小鼠相比，出现了34个差异表达的片段。进一步研究证明有18个是假阳性，有6个在Northern分析中没有带，因此只有10个似乎与缺陷有关。其中有一个超量表达的片段长582bp，测序后发现其与小鼠铁蛋白mRNA基因有100％的同源性，这表明肝细胞对铜缺乏的反应是过量表达铁蛋白基因。在人和动物的反复观察中也验证了这点。

2  RT－PCR定量技术
  
    PCR技术对基因从定性到定量的测定是分子生物学研究方法-大飞跃。定量PCR已成为目前分子生物学技术研究的热点之一，根据其检测的方法和定量的原理不愿为半定量PCR（semi－quantitativ  reverse  transcriptasepllymerase chain reaction）。

2.1  半定量PCR
   
    在生物体内有些基因在其整个生长过程中都表达，不受组织、器官的限制，也不受生长阶段、生理状态的影响，这样的基因称为看家基因（house  keeping  gene），如GAPDH（glyceraldchwle－3－phosPrate  derydrogenuse，GAPDH）β－actin等。半定量PCR就是利用它们作为标准，靶序列和标准序列进行PCR扩增后，进行琼脂糖电泳，EB染色后在UV照射下直接拍照，进行密度扫描，得到靶序列的相对量。在进行半定量PCR实验设计时，要考虑到许多因素，如PCR循环条件（包括循环次数、变性、退火、延伸的温度、时间等），试剂的浓度（dNTPs、引物、模板、Taq酶等）以及寡核苷酸引物的长度，特异性等。由于PCR的高灵敏性，反应混合物中混有微量的基因组DNA也能被扩增出来。所以，在设计引物时，扩增片段应跨一个内含子，这样即使有基因组DNA得到扩增，也能通过其长度不同而在琼脂糖凝胶电泳中轻易地分离出来，保证反应的特异性。另外，最重要的是要保证PCR反应处于扩增指数相，因为如果达到平台期，不同起始浓度的模板都会达到相同的量而失去了比较的意义。

2.2  竞争性PCR

    竞争性PCR是在同一反应条件下，同一试管内对靶序列和竞争模板的cDNA同时扩增。靶序列和竞争模板使用同样的引物，但经扩增后可以把它们区别开来。扩增后，当二者的终浓度相同时，理论上其模板浓度也应相同。竞争模板可以是一种突变的cDNA，其中含有一个新的酶切位点，用内切酶消化PCR产物的方法可以从靶cDNA中区分出突变模板；还可以在靶序列中央插入或缺失几个碱基的DNA片段来作为竞争序列，插入或缺失序列的长度以扩增后能使2种产物在琼脂糖凝胶电泳上分开为宜，不能太长，以免竞争模板的扩增效率与待测模板不一致。这两种方法都能很好地保证2种模板具有相同的扩增效率，但也存在着明显的不足。根据竞争模板与待测模板长度的细微差别来区别扩增产物，虽能使两种模板的扩增效率趋于一致，但是在变性／退火的过程中，会产生异源双链和同源双链两种产物，在通常的非变性电泳的条件下，不能使它们分离开，这降低了竞争性PCR的敏感性。增加了衡量的难度。在竞争模板中引入新的酶切位点虽然避免了上述问题，但费用高，费时费力。用与靶序列非同源的序列作为竞争模板，可以避免异源双链的形成，但是会出现两种模板扩增效率不同的情况，同样会影响定量的准确性。为了克服这一缺点，Delarue B等在进行兔颗粒细胞芳香酶cDNA的定量研究中，引入了校正系数，极大地提高了测量的准确性。
 
    Li Cui等利用竞争性PCR技术研究白细胞介素-1α诱导金属硫蛋白基因表达是否受锌缺乏的影响。他们把试验小鼠分为三组：一组自由采食锌含量充足的日粮（AL），另一组饲喂缺乏锌的日粮（ZD）（2mg/kg），第三组用锌含量正常的日粮进行限饲，使其采食量相当于锌缺乏组的小鼠（PF）。当这些小鼠分别饲喂四周后，皮下注射白介素一1α，3，6，12，24，72小时后杀死，进行分析。与AL或PF组相比，ZD组的小鼠的肝脏回和血浆中锌含量降回低，肠和肾脏中的锌浓度无变化。同时，肝、胃、肠中金属硫蛋白mRNA表达水平显著降低。注射白介素一1α后，血浆中锌浓度减少，肝脏中锌浓度增加，肾和小肠中锌的含量无变化。各试验组小鼠的肝、胃、肠中金属硫蛋白的mRNA量都显著升高。在注射白介素6小时后，ZD组小鼠肝、肾中金属硫蛋白的mRNA水平显著高于AL、PF组。研究还发现，在注射了白介素1α后，AL和ZD组小鼠的金属硫蛋白的含量也提高。在注射白细胞介素之前，ZD组小鼠肝脏内白细胞介素1受体I的含量显著高于AL、PF组，而在肾和小肠组织中无变化。这些都表明锌缺乏促进白细胞介素1α诱导金属硫蛋白基因的表达。
  
    Vicki K.Sullivan和Robert.Cousins通过用竞争性PCR技术研究日粮中添加锌和单核细胞中金属硫蛋白mRNA水平的关系，表明金属硫蛋白mRNA是监测人体中锌水平的合适变量。人体中锌的含量很难检测，日粮锌对金属硫蛋白基因表达的调节属转录调节，因此它可以作为相关功能的评价参数。他们用竞争性PCR技术对添加锌和对照组15天内的单核细胞中金属硫蛋白mRNA水平进行定量研究，发现与对照组相比，在添加锌的第6天，单核细胞中金属硫蛋白mRNA水平显著提高，这种升高持续到第15天；而血浆中锌的水平在第6天比对照组提高了80％，在第15天又显著下降，此时，其锌的含量是对照组的20％，这表明单核细胞中金属硫蛋白mRNA的水平与锌的添加相关，而且比血浆锌的含量更适于表示人体内锌的水平。

3  基因剔除(gene knock-out)
  
    尽管早期的研究多数集中于基因表达的营养调节，转基因技术也被用于研究日粮组分对特定基因过量表达的影响。最近建立起来的基因剔除技术，更是为研究特定基因的功能，及基因突变、缺失对新陈代谢的影响机制提供了有力工具。
  
    基因剔除是利用胚胎干细胞(embryonic system,ES)作为打靶载体的受体细胞。 ES细胞具有与早期胚胎相似的高度分化的潜能，可在体外培养、克隆、增殖、冻存等。当把它注射到其它的胚胎，或者移植人代孕母亲体内时，它能够保存分化的能力。在一个典型的基因剔除试验中，ES细胞和受体胚胎分别来自于被毛颜色不同的动物，这样可以通过后代被毛颜色的不同来选择嵌合体。
  
    基因剔除的成败取决于转染的DNA与染色体上同源基因重组与否，虽然随机整合的比例远远高于基因剔除，研究者们已建立了一些方法促进同源重组的发生及快速筛选发生基因剔除的细胞。为了保证高效率的基因剔除事件的发生，大多数试验利用和目的基因有微小差异的基因进行基因剔除。对外源DNA的长度也有一定要求，以不小于4kb为宜。另外，在目的基因中插入选择标记（如Neor基因），既可以破坏该基因的编码序列，又可以根据该基因表达与否，对发生了重组的ES细胞进行筛选。这时筛选出的重组ES细胞包括同源重组和随机整合2种情况，在一个成功的试验中，约有0.1％～10％的抗生素抗性的细胞发生了基因剔除。有的研究者在打靶载体的末端加上一个阴性筛选标记。在基因剔除事件里，阴性筛选标记基因不表达，而非同源位点的随机整合则会伴随着该基因的表达，这样，就可以使人们从表型性状上区分出随机整合和基因打靶。
  
    传统的营养实验对于胆