朱晓华，赵万里，王志跃（扬州大学畜牧兽医学院，江苏 扬州 225009）

家畜性别控制（Sex Control）是一项能显著提高家畜繁殖效率的生物工程技术，对家畜育种、生产和遗传疾病的防治均有非常重要的意义。随着细胞遗传学、免疫组织化学、分子生物学等学科的迅速发展，高精密仪器的研制成功，为性别控制的研究提供了理论依据和先进手段。

1 性别决定的生物学机制

1.1 性别决定的发育学机制

家畜胚胎发育的早期阶段为性别未分化期，仅有位于中肾内缘的性腺原基，这种未分化的性腺中胚层处于中性。家畜性别决定的取向是未来性腺发育的导向，而性别决定的结果又是通过性腺分化及性表型来体现的。胚胎生殖腺的发育类型是性别形成的决定物质。对兔胚胎阉割后的试验表明，在内外生殖器组织分化的临界时间前，无论对雌性还是雄性胚胎切除发育中的生殖腺，均导致了胚胎的内外形态上向雌性发育。说明胚胎中睾丸组织的存在是促使雄性性状发育或者阻止雌性性状发育的必需物质。当生殖腺原基被某种信息诱导发育为卵巢，由卵巢产生的雌激素则使苗勒氏管（mullerian duct, MD）发育为阴道、子宫和输卵管。如果性腺原基发育为睾丸，其间质细胞分泌睾酮，支持细胞分泌抗苗勒氏管因子（anti-mullerian duct factors AMDF），诱导中肾管发育成附睾、输精管和精泡等内生殖器。生殖道中生殖腺分布和发育的异常，将导致不同程度的雌雄同性。

1.2性别决定的遗传学机制

从本世纪以来，对性别形成的研究已从形态学向配子发生和胚胎形成的过程深化。现代遗传学的发展进一步认识到性别决定区域位于Ｙ染色体短臂的非同源区，与Ｘ染色体配对的同源区并不起决定作用，从而使对性别的认识提高到分子水平。

Sinclair et al.（1990）在人类Ｙ染色体的短臂近似常染色体区域分离和克隆到一个单拷贝基因，与性别决定相关，称之为性别决定区Y基因（Sex－de-Hogg等发现SRY/Sry蛋白与P450芳香化酶基因及苗勒氏管抑制因子MIS(mullerian inhibiting sub-stance)基因的启动子序列有较强的亲和性，并认为它们是受SRY/Sry基因调控的候选基因。从而为上述机制提供了有力的证据。

2 性别控制的研究

性别控制主要是通过两种途径，即Ｘ、Ｙ精子的分离和早期胚胎性别的鉴定来实现的。

2.1 精子的控制

分离Ｘ、Ｙ精子并用于人工授精或显微授精是控制家畜性别最简单、可行的方法。Ｘ、Ｙ精子分离主要是依据两类精子理化特性的不同而进行的。关于这方面国外科技工作者进行了多方面研究，发现Ｘ、Ｙ精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异。Ke－hui Cui（1997）证实Ｘ精子在长度、头部面积、周径、颈部长度、尾长等形态上显著大于 Ｙ精子，从而为分离精子提供了依据。

根据两类精子理化特征上的细微差异，人们设计了诸如沉降法、离心法、过滤法、电泳法等来分离Ｘ、Ｙ精子，并有控制性别比例的报道，但许多研究结果的可重复性很差，并且后代出生的性别比例并没有明显超出自然出现的性别比例范围，实际生产中推广的意义不大。近年来发展起来的免疫学方法和细胞流式分类器在分离两类精子的效率上显示出较大的优势。

应用免疫学方法分离精子是从Eichwald和Silmser（1955）发现雄性特异性弱组织相容性Ｙ抗原(male specific minor histocmpatibility-Y anti-gen)，简称Ｈ-Ｙ抗原，后逐渐发展起来的。现已证明H-Y抗原被保留在整个进化过程中，除了某些过渡品种外，在所有异配子型性别品种的体细胞中均发现H-Y抗原存在。许多实验都证实，只有Ｙ精子才能表达H-Y抗原，因而，利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原，再通过一定的分离程序，就能将精子分离成为H-Y+(Ｙ精子)和H-Y-（Ｘ精子）两类。将所需性别的精子进行人工授精，即可获得预期性别的后代。H-Y+ 、H-Y-精子分离的主要方法有：免疫亲和柱层析法、直接分离法及免疫磁力法。Bradley（1989）用免疫亲和柱层析法分离绵羊的H-Y+ 和H-Y-精子，发现不被层析柱上而后被洗脱下来的有70%～80%为H-Y-，结合到层析柱上而后被洗脱下来的有75%～80%的H-Y+，对照组有43%～44%为H-Y+ ，56%～57%为H-Y-。虽然该法分离精子的效率较高，然而经处理后的精子数目少而且活力低，很难在实际生产中应用。

Johnson（1994）研究表明X与Y精子在染色体的DNA组成上存在最高可达12.5%差别，依据这一原则设计出的流式细胞分类器可将Ｘ与Ｙ精子分开并进行体外受精，已获得预期性别的牛、兔、猪、绵羊的活后代。Senger研究证实，用此法分出的Ｘ精子给母兔授精，获得94%的雌性仔兔，用Ｙ精子授精获81%雄性仔兔，表明该法基本上能将Ｘ和Ｙ精子分开。目前流式细胞分类器分离Ｘ、Ｙ精子是所有方法中效率最高的，日本已将该法做为实施性别控制技术的基础。但此法分离速度很慢，且仪器价格昂贵，目前尚不能进入实用阶段。

另外，国内外研究者还探讨了限制Ｙ精子的活力来对家畜进行性别控制。这主要是基于Ｙ-精子较Ｘ-精子具有体型及比重小、抗力差、运动快、耗能多、存活时间短等特点，控制输精时间，调整子宫预内粘液的Ph值以及改变冻精的解冻温度等来实现的。但研究所得的结果不稳定，这可能是由于①很难时Ｘ、Ｙ精子之间的差异程度进行具体量化；②对家畜繁殖生理过程不能精确调控；③公畜个体之间存在差异。

2.2 早期胚胎的性别鉴定

早期胚胎的性别鉴定也是实现家畜后代性别控制的主要途径之一。目前已有好几种方法可以达到这个目的，如①细胞遗传学法，即通过核型分析来完成胚胎性别鉴定，这种方法鉴定胚胎性别的准确率几乎是100%，但操作过程比较烦琐；②Ｘ染色体连接酶活力测定法，即检测桑椹胚至囊胚期这段时间Ｘ染色体连锁酶活性，即葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性，以预测胚胎性别，这种方法鉴定胚胎的准确率较低，主要原因是不知道Ｘ染色体失活的确切时间；③H-Y抗原法，包括细胞毒性分析法和间接免疫荧光法。细胞毒性分析法是将胚胎培养在含有H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）的培养液中进行培养，有H-Y抗原的胚胎表现出一定的细胞溶解，此类胚胎被判为雄性胚胎，但该方法以破坏雄性胚胎为代价，很少采用；间接免疫荧光法则将8-细胞至囊胚期胚胎与H-Y抗体反应30 min，再与异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的免疫球蛋白Ｍ（IgM）抗体反应，随后镜检，有荧光素的胚胎判为雄性，该法不损害胚胎，准确率比较高，猪、绵羊、牛雌性鉴定准确率分别可达81%、85%和89%。

虽然以上这些早期胚胎性别鉴定技术业已成熟，但这些方法要么准确率不高、要么费时，不适宜在实际生产中应用推广。而现代分子新技术的进步尤其是针对性别决定区特定基因序列的聚合酶链式反应（PCR）方法和荧光原位杂交技术（FISH）提供了早期胚胎植入前鉴定性别的准确、高效、快速的新方法，使性别鉴定和控制进入现实可操作阶段。

PCR扩增法是一种模仿体内DNA复制的过程，它主要是针对SRY/Sry的DNA序列设计特异引物，并通过PCR扩增胚胎SRY/Sry特异DNA序列来鉴定胚胎的性别，该法因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特点，近年来得到迅速的发展。研究者应用PCR扩增SRY基因已对牛、小鼠附植前胚胎成功地进行了鉴别鉴定试验。另据Fujishiro等（1995）报道用PCR扩增法还可对妊娠母牛的各种类型的异性孪生症作出快速、准确的诊断。但与FISH相比，PCR也可能扩增靶基因以外的DNA，而且PCR易污染，性别鉴定中有失败的报道（Stron CM.et al.1991）。

FISH包括荧光素探针制备、探针和靶DNA的变性与杂交、观察鉴定三部分。由于FISH技术制备了特异性序列片段探针、杂交在细胞内进行、 能使用试验而发光、显色，既能在细胞分裂间期杂交，也能在分裂中期杂交，更具广泛的应用性。Santiaqo munne等（1993）用绿色荧光素标记Ｙ染色体特异序列探针，红色荧光素标记Ｘ染色体重复序列探针，对处于4 d前8细胞期的人胚胎进行了共68个分裂球双探针FISH检测，仅使用6 h 就完成了从显微操作到显微观察的整个过程，准确检测了胚胎性别，其中有效率达95.5%(65/68)。若有8号染色体探针进行再次杂交，还可鉴定分裂球的倍体变异。由于FISH允许使用体细胞杂交探针与X和Y探针结合检测性别中的非整倍体变异。因而具有高效快速和错误率低的优势。

从上述现状来看，在畜牧业生产中应用现代分子新技术，对早期胚胎进行快速、准确的性别鉴定是可行的，并且产生了所需性别的后代。但由于早期胚胎性别鉴定需从胚胎上取下少量细胞，因而性别鉴定的胚胎，经冷冻-解冻处理仅有少量胚胎存活，导致胚胎移植的成功率下降，同时劣质胚胎的性别鉴定成功率更低。这就制约了提供预知性别家畜胚胎的商业化进程。故发展一种快速、准确的，尽量减少对胚胎产生损害的非侵害性方法以鉴定早期胚胎性别，当是研究者今后努力的方向。