【哺乳动物卵母细胞体外培养研究进展】 中国农业大学生物学院  王海滨 夏国良 李美玲 吕忠显 张建超 邵育静

    摘要：哺乳动物卵母细胞体外生长、发育研究已经取得了巨大进步，建立了许多培养体系。本文结合我们近些年对小鼠胚胎卵巢泡发育研究结果简要综述当前卵母细胞体外培养体系的研究进展。

　　哺乳动物卵巢内含有大量原始卵泡，其数量因物种和发育阶段不同而异。如：出生时小鼠约为1万个，人和家畜约为几百万个；而到初情期小鼠约4000多个，绵羊、牛约10万多个，猪约40多万个。大量原始卵泡组成的卵泡库被认为是雌性生殖资源的储备库，卵母细胞就是从原始卵泡库中持续、小批量地起始生长，并不停地有少量发育安全的成熟卵母细胞恢复、完成减数分裂，最终排卵。在雌性个体一生的生殖活动中能够成熟排卵的仅为原始卵泡库中极其有限的一小部分。近10年来，胚胎例外生产技术发展迅速，对具有发展潜力和受精能力的高质量的卵母细胞需求量日益增加。探索卵母细胞/卵泡在体内和体外发育的调节机制成为了当前卵巢生理学研究的热点和难点之一。1996年Ｅppig和Obrien将来源于原始卵泡的卵母细胞体外培养成熟，并以体外受精、胚胎移植得到后代。这为进一步利用小卵母细胞经体外发育、成熟来生产大家畜提供了可能。目前建立了许多可供卵母细胞体外生长的培养模型。本文结合我们近些年的研究结果简要综述当前卵母细胞体外培养体系的研究进展，存在问题以及可能的解决方法。

    1、卵母细胞的体外生长

　　卵巢的结构和功能单位是卵泡。体外培养小卵母细胞和小卵泡是研究卵母细胞和卵泡发生、发育的重要方法，为此建立了许多培养体系。新生小鼠、大鼠、兔是非常适宜进行卵母细胞体外生长研究的实验动物，因为在这一时期获得大批量发育程度相近的卵母细胞到出生后才开始起始生长，在产后2-5d即有一群卵泡（数量较多）进入生长相，形成一个卵母细胞/卵泡同步生长波。到26-30日龄啮齿类卵巢中已含有大量处于不同发育阶段的卵母细胞。小鼠有腔卵泡在14日龄左右开始形成，在这一时期可以最早获得具有部分恢复减数分裂能力的卵母细胞。从早于13日卵巢中获得的卵母细胞大多来源于腔前卵泡，不具备恢复减数分裂的能力。大鼠卵母细胞第一次获得恢复减数分裂能力要稍晚几天。兔的卵泡生长起始要比小鼠、大鼠的更晚，到6-7周龄卵巢中含有大量第一次卵泡发育波形成的早期有腔细胞。因此从某一特定日龄啮齿类卵巢中可以获得大量发育程度相近的小生长卵母细胞。

　　1977年Ｅppig第一次利用小鼠小卵母细胞进行体外培养研究发现从8日龄小鼠卵巢采集得到的小生长卵母细胞，经过体外培养，部分卵母细胞可以发育成熟。从小鼠卵巢中采集腔前卵泡再体外培养发育至有腔卵泡已经取得显著成就。FSH促进腔卵泡在体外形成卵泡腔。体外发育而成的有腔卵泡在ＬＨ的作用下可以排出能够完成受精并具有早期胚胎发育能力的成熟卵母细胞。

　　在研究卵泡发育同时，许多研究小组为重点研究卵母细胞的生长发育，建立了许多完全不同于早期的完整卵泡的培养体系。上面已述及从小鼠卵巢获得大批量发育程度相近的卵母细胞相对容易，因此许多卵母细胞体外培养体系都首先在小鼠中获得成功。

　　1.1鼠卵母细胞体外生长 目前已建立许多适宜于小鼠卵母细胞体外生长的培养模型。处于生长相中期的小鼠卵母细胞利用这些培养模型可以在体外发育成熟，其中70%-80%能够完成减数分裂并在体外正常受精。利用体外成熟的卵母细胞经体外受精已经成功获得后代。

　　1.1.1母细胞－颗粒细胞复合体（OGCs）培养 利用胶原酶消化可以从腔前卵泡中分离得到大量OGCs，它由中间的卵母细胞和外周1-3层颗粒细胞组成（或膜细胞的前体细胞），并可将基底膜降解。正是因为OGCs培养在用Ｉ型和ＩＩ型胶原预先浸润的衬膜上以阻止颗粒细胞的游离。和完整卵泡培养时存在的培养液和卵丘－卵母细胞复合体间的膜颗粒细胞层。同时它也存在许多不中，譬如：卵泡体细胞或卵母细胞分泌的许多对卵母细胞生长、分化起重要作用的因子在卵泡液中可积聚至较高浓度发挥作用而在培养液中却不能积聚到有效浓度。并且因为膜细胞已经被去除，由它们产生的益于卵母细胞发育的物质只能额外添加。

　　阻止OGCs体外培养时颗粒细胞发生游离还有许多方法。Ｔorrance将整个OGCs用胶原包埋培养，但这种培养体系的缺陷是卵母细胞的重新获取将非常困难，而且这种体系中卵母细胞的发育进程和贴壁于胶原基质培养时发育进程并不一致。Ｈirao则用1%的琼脂覆盖培养孔底壁以阻止颗粒细胞贴壁，但因OGCs在这种培养体系中是悬浮生长，不适宜用于长期培养。

　　OGCs体外培养时必须添加减数分裂阻滞物如：3－IBMX、次黄嘌呤（HX）等，因为卵母细胞发育至一定阶段后可以获得恢复减数分裂能力。众所周知成熟卵泡释放的卵母细胞可以自动恢复减数分裂。卵母细胞阻滞于减数分裂是由减数分裂抑制因素控制的。ＨＸ已被证实是一种减数分裂抑制物，存在于小鼠、猪的卵泡液中。OGCs中的小卵母细胞在生长早期还不能恢复减数分裂，卵母细胞进一步生长、发育至一定阶段即可自动恢复减数分裂。而培养过程中恢复减数分裂的卵母细胞会闭锁死亡。培养体系中加入减数分裂阻滞物后卵母细胞即使已经发育完全也会被阻滞于第一次减数分裂的前期即GV期。

　　1.1.2卵巢器官或皮质薄片培养 在早期的卵母细胞体外培养生长实验中，就有关于整个卵巢进行体外培养的报道。当将产后不久的小鼠卵巢进行器官培养时，卵巢内所含的15-20μm原始卵泡卵母细胞会起始生长。业已证明来自于4日龄的小鼠的卵巢进行体外培养，可以从原始卵泡获得具有受精能力的卵母细胞，并经受精、移植后产下一只小鼠。这是首次从原始卵泡培养到成熟受精并产仔的报道。虽然他们的两步法流程用以生产后代效率仍很低，但至少说明原始卵泡库是一个可以被开发利用的潜在的巨大的雌性生殖资源。器官培养在上述两步法中起到了重要作用，因为它能很好地维持卵母细胞与颗粒细胞间以及不同卵泡间的正常联系，利于原始卵泡起始生长。但是由于器官培养，特别是体积较大的器官体外培养时需要灌流，因此这种培养方式不利于卵巢的长期培养。新兴的卵巢皮质薄片培养技术是替代卵巢器官培养的一个较好方法。它既保留了卵巢整个器官培养时的优点，又同时克服了器官培养时的缺点，并且卵巢皮质薄片培养可以去卵巢髓质分泌的抑制因子对卵母细胞在体发育的抑制作用，进而可以在体外同时得到大量发育程度相近的卵母细胞。目前利用器官培养或皮质薄片培养已证明能够成功地在体外启动原始卵泡的生长。

　　1.1.3小鼠胚胎卵巢培养 小鼠卵原细胞在妊娠13d进入减数分裂形成卵母细胞，进而被颗粒细胞包裹形成原始卵泡。目前对起始卵母细胞生长的信号仍知之甚少。其中一个重要的原因就是缺乏一个良好的研究模型。我们以妊娠13d昆明白小鼠胚胎卵巢为研究材料建立了一个益于小鼠胚胎卵巢卵胞/卵母细胞体外生长发育的无血清培养模型。血清作为一种促生长成分曾被广泛应用于细胞培养。在体外培养小鼠胚胎卵巢研究中我们发现血清可以促进巢体细胞贴壁并从卵巢游离生长，使卵巢丧失完整结构，卵母细胞也因得不到颗粒细胞的足够支持而大量闭锁退化。ITS和胎球蛋白（Fetuin）是目前应用日益广泛的血清替代物。越来越多研究证实ITS能促进原始卵泡卵母细胞生长启动，并提供生长所需的一种或几种因子。而Fetuin可能是一种卵泡液或血清的组分，它不但能抑制透明带硬化，更是卵母细胞生长、发育所必需的。因此我们以ITS+Fetuin为血清替代物全程无血清培养小鼠胚胎卵巢，结果发现胚胎卵巢不能很好贴壁。基于上述研究我们分两步培养胚胎卵巢:首先添加2%胎牛血清对卵巢进行贴壁培养5d;再以ITS+Fetuin为血清替代物继续培养胚胎卵巢14d(相当于到产后13d)。实验发现:小鼠胚胎卵巢在体外有血清条件下至少需要3d才能贴壁，5d后才能很好地展开;经过14d的无血清培养胚胎卵巢中有大量原始卵母细胞起始生长，到培养中后期胚胎卵巢中出现许多早期次级卵泡。小鼠胚胎卵巢个体很小通过每天半量换液可以克服成年动物卵巢器官培养时营养供应匮乏的缺陷，同时卵巢髓质分泌的抑制因素也因换液得以清除。因此结合常规分离方法可以得到大量OGCs供成熟发育研究。重要的是我们所建立的胚胎卵巢无血清培养体系摈除了血清中许多未确定因素可能对卵母细胞发育造成的影响，因此它适宜用于卵母细胞生长、发育调节机制的研究。利用这一模型我们研究发现卵泡刺激素(FSH)并不是小鼠胚胎卵巢原始卵泡生长起始所必需，而一些生长因子如：EGF可能参与这一过程。当小鼠胚胎卵巢添加EGF无血清培养时生长卵泡数量显著增加，到培养后期许多卵母细胞直径达55-60μm。虽然我们建立的胚胎卵巢培养体系具有上述许多优点，但也存在一些局限。如：仅适用于小动物卵巢培养;培养效果受一些物理因素影响，譬如:培养体系中添加100μL矿物油覆盖培养液对具有更好的培养效果。

　　1.1.4小鼠胚胎卵巢细胞体外重建卵泡 卵母细胞在发育进程中经历了多次选择。从卵原细胞进入减数分裂转变成初级卵母细胞开始到发育成熟后排卵一共经历了三次存与亡的抉择，分别是：卵原细胞进入减数分裂转变成初级卵母细胞，并被卵巢体细胞包裹形成原始卵泡;原始卵泡启动生长;优势卵泡选择。尤其第一次选择，因为只有进入减数分裂，形成原始卵泡的卵母细胞才能存活，才可能有进一步发育的机会。人卵巢中生殖细胞总量在妊娠中期达到顶峰：6-7x106，其中2/3为初级卵母细胞，其余1/3为卵原细胞。但是到出生时生殖细胞仅剩l-2x106，大量生殖细胞已闭锁退化。原始卵泡形成是卵巢体细胞和初级卵母细胞相互识别的过程，而目前人们对调节这过程的机制知之甚少。我们以不同日龄胚胎卵巢(妊娠13、14、15、16d)为研究对象，利用胶原酶消化得到单个游离的卵巢细胞，再利用微液滴 (50μL)培养发现：妊娠16d的胚胎卵巢细胞可以在体外重新形成卵泡。这为我们进一