汪以真，韩新燕，许祥荣
（浙江大学动物分子营养学教育部重点实验室，浙江大学饲料科学研究所，杭州３１００２９）
摘要：抗菌肽是阳离子型活性肽，是哺乳动物防御体系的一个重要组成部分，具有分子量小，热稳定性好，无免疫原性，抗菌普广等特点，通过改变细菌细胞膜的通透性而发挥抗菌作用，这不同于抗生素通过阻断大分子生物合成的作用理．因而致病菌不易对其产生耐药性。本文就几种哺乳动物抗菌肽特性、抗菌机理、基因表达及其研究展望和存在题进行了综述。
关键词：抗菌肽；作用机理；基因表达；哺乳动物
中国分类号：S852.215文献标识码：Ａ文章编号：０２５８－７０３３（2002）04-0052-03
抗菌肽（ａｎｔｈｅｔｅｒｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ）是生物体产生的一种具有抗菌活性的多肽，１９７２年，瑞典科学家Ｂｏｌｎａｎ等首先在果蝇中发现抗菌肽及其免疫功能，随后首先从惜古比天蚕蛹诱导分离到并命名为cecropin。迄今为止，已在许多生物中发现３00多种这样的内源性抗菌肽，可大致分为四类：cecropin（杀菌肽）类；富含ｐro残基的magainin（蛙皮素）；富含gly残基的melittin（蜂毒素）；富含cys残基的defensin(防御素）。这些抗菌肽除了具有广谱的抗菌活性外，同时还有高效的抗真菌和（或）抗病毒和（或）原虫和（或）抗肿瘤活性。因此，这些肽类抗菌物质显示了在医学和农业上潜在的研究和应用价值。
1不同哺乳动物的抗菌肽及其特点
１．ｌ猪抗菌肽 猪的小肠是一个重要的内分泌器官，许多生理活性肽由此分泌。在健康状况下，小肠上段几乎无菌，而十二指肠往后细菌浓度逐渐增加，到了大肠，每克内容物达１０[11]细菌，如此多的细菌能共存于寄主器官中，所以人们猜测小肠可能会产生一种抗菌因子调节肠前段的细菌浓度从而保护肠粘膜.
Lee等（１９８９）首先从猪小肠分离到抗菌肽cecropinＰＩ，含３１个氨基酸残基，分子量３３３９Ｄａ，不含Ｃｙｓ。与昆虫cecropinＩＡ和cecropinＢ分别有６４％和75%的相似性。ＰＲ-３９是另一个从猪小肠分离到的抗菌肽，分子量４７１９Ｄａ，只含７种氨基酸，富含Ｐｒｏ和Ａｒｇ。它对C-菌如大肠杆菌、沙门氏菌和Ｇ+菌如巨大芽胞杆菌和化脓链球菌都很敏感（Agerberth等，１９９１）[1]。肽３９１０也从猪小肠分离，其Ｃ-端酰胺化，对巨大芽胞杆菌敏感。Ａｎｄｒｓｓｏｎ等（１９９５）又从猪小肠纯化一个78残基的抗菌肽ＮＫ-ysin，分子量８９２４Ｄａ，并从猪骨髓ＤＮＡ文库分离到它的克隆。它有三个分子内二硫键，对大肠杆菌、巨大芽胞杆菌。醋酸钙不动杆菌和化脓链球菌有抗菌活性，而且对ＮＫ-敏感型小鼠肿瘤细胞株ＹＡＣ－ｌ有显著裂解活性，但不裂解红细胞[2]
猪白细胞中分离的抗菌肽称prortegrins（ＰＧｓ），富含Ｃｙｓ，具抗Ｇ＋菌和Ｇ-菌及ＨＩＶ病毒活性。其中ＰＣ－ｌ有二个分子内二硫键，Ｃ端酰胺化，二级结构为β-折迭，在脂质双层中PG-1呈Ｓ状态向ｌ状态转变过程。在Ｓ状态PG-1与膜相互作用并以剂量依赖方式降低双层膜的厚度直至跨越双层膜，随即转变为状态（Hellr等，２０００）[3]
１．２牛、羊抗菌肽 较早从牛中性粒细胞分离的是一个环状的十二肽bactencin，含一个二硫键。其二级结构为β-转角，它对野生型G-菌特别敏感，与脂多糖有很高亲和力，从而有利于渗透细菌外膜。Bac７和Bac5是线性阳离子肽，分子量分别为７000Ｄａ和5000Ｄａ，与ＰＲ－３９相似，也富含Pro和Ａｒｇ。体外试验表明能有效杀灭沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等Ｃ-菌。Indolicidin是Ｃ端酰胺化的阳离子十三肽，富含Trp，呈两亲性转角构型，具有抗Ｇ＋菌和G－菌及真菌活性。
β-defensins是一组具有独特氨基酸序列的抗菌肽，含３８～４２氨基酸，有３个分子内二硫键，其中６个Ｃｙｓ残基在肽链上所处位置与defensins家族不同，且Ｎ端有一个不同于defensins的５-羟脯氨基。从气管上皮发现的抗菌肽ＴＡＰ和舌上皮发现的抗菌肽ＬＡＰ均属β-defensins家族，分别由４２和３８个氨基酸组成，都有抗G+菌和G＋菌及真菌活性（Schinwetter等，1995）[4]
绵羊、山羊白细胞分离的抗菌肽ＯａＢａｃｓ和ＣＨＢａｃｓ与牛Ｂａｃｓ同源，富含Ｐｒｏ，具有广谱抗菌特点，且在低盐浓度下仍有抗菌活性。富含Ｐｒｏ的Ｂａｃｓ肽类在反刍动物中高度保守，这可能有利于其先天的防御体系（Ｓhamova等，１９９９）[5]
２抗菌肽的作用机理
几乎所有抗菌肽都是阳离子型，大多具有两亲α-螺旋和（或）两亲β-折迭结构。Boman等（１９９３）[6]研究了猪cecropinＰＩ和ＰＲ-３９对大肠杆菌的作用机理，与cecropinＰＩ不同的是，ＰＲ-３９杀死正在生长的细菌比处于非生长状态的细菌要快得多，cecropinＰＩ与昆虫抗菌肽一样也通过改变细菌细胞膜通透性而杀菌；而ＰＲ-３９则通过阻断细菌蛋白质和ＤＮＡ的合成而杀灭细菌。cecropinＰＩ在结构上与昆虫cecropins相似，它在细胞膜上也形成了电势依赖通道，这与Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等（１９８８）[7]的报道一致，其杀菌过程为：首先抗菌肽分子两亲ａ一螺旋上的正电荷与细菌质膜磷脂分子上的负电荷通过静电相吸而靠近；接着借助于分子中Ｎ端与Ｃ端间的连续结构的柔性，抗菌肽分子中的疏水端插入质膜中；然后两亲性ａ-螺旋也插入质膜中，这样就破坏了脂质双层原有的有序结构，由于ａ-螺旋的两亲性使抗菌肽分子通过膜内分子间的位移而相互聚集在一起，从而在膜上形成离子通道，细菌最终不能保持正常渗透压而致死。
哺乳动物防御素的二级结构是两亲β-折迭，其杀菌机理类似于cecropins在膜上形成离子通道。从人防御素的二聚体晶体结构，Hill等（１９９１）[8]认为防御素分子可能有三种方式与脂质双层相互作用并渗透质膜，提出了渗透脂质双层的楔形模型和孔道模型假说。在楔形模型中，二聚体的疏水表面埋入脂质双层中，破坏脂质双层间的相互作用从而渗透质膜；在孔道模型中，两个二聚体在质膜中装配成极性的头对极性的头，两个非极性的尾对磷脂膜的模式，两个二聚体的尾部四个疏水性侧链形成两个微型通道（mini-channe），且完全横跨双层膜；或者，上述二聚体旋转90度，然后几个二聚体首尾相连从而横跨质膜，形成孔道。而与ＰＲ-３９结构相似的Ｂａｃ5和Ｂａｃ７，由于Pro残基的存在也不能形成个螺旋，它们通过影响膜上的能量转运和代谢、损害呼吸链的功能而杀死细菌。
３ 抗菌肽的基因表达调控和基因工程
猪ＰＲ３９基因结构相当紧密，大小只有１７８４ｈＰ，定位于１３号染色体，含４个外显子和３个内含于，其中抗菌肽ＰＲ-３９由第四个外显子编码。在ＰＲ３９基因启动子区域，ＴＡＡＡ序列可能发挥ＴＡＴＡbok功能，该区域还存在一个转录调控因子IL-６识别位点，表明ＩＬ-６在调控ＰＲ３９基因表达中起重要作用，通过Northern blit分析，只在猪骨髓检测到特异的ＰＲ-３９ＲＮＡ，说明，ＰＲ-３９在骨髓中合成。
牛ＴＡＰ基因含２个外显子和１个内含子，仅限于成年牛的鼻到支气管整个呼吸道纤毛上皮中高水平表达，在胎儿中无表达。用细菌或脂多糖诱导，ＴＡＰmRNA水平大为提高，表明ＴＡＰ基因表达在转录水平被调控（Diamond等，２０００）[9]。牛ＬＡＰ基因也含２个外显子和１个内含子，可在呼吸道、胃肠道、泌尿道、生殖道、结膜等多种上皮组织表达，而是在孕胎儿中则无表达。在急慢性炎症区域，LAPmRNA表达水平明显提高，ＬＡＰ可能有利于创伤组织的无菌化，也可能参与创伤修复（Schonwetter等，１９９５）[4]
绵羊ＳＢＤＩ、ＳＢＤＺ基因均含２个外显子和１个内含子，定位于26号染色体，而牛β-defensins定位于与其同线性的27号染色体。ＳＢＤＩ和ＳＢＤＺ基因从羊舌到直肠上皮均有表达（ＳＢＤＩ除回肠末湍），而且在同一个体不同组织、不同个体同一组织ＳＢＤｍＲＮA表达水平不同。在胎儿期，９月龄胎儿ＳＢＤ基因表达水平最高。这些都说明了ＳＢＤ基因表达在出生前后发育中的调控，且具有不同于牛的表达方式，从而为进一步研究在日粮和药理水平调控抗菌肽基因的表达提供了依据（Huttner等，1998）[10]
运用基因工程方法，把牛ＴＡＰ基因导人小鼠乳腺，在小鼠乳中检测到了牛ＴＡＰ的存在，说明乳腺能转录出相应的ＴＡＰ抗菌肽类，且ＴＡＰ重组体数量多，比基因工程法合成抗菌肽费用低（Ｙarus等，1996）[11]。如果用相同方法，把抗菌肽基因转入猪体内，从而产出抗大肠杆菌感染的转基因仔猪，其经济效益和现实意义不言而喻。转基因鼠为体内研究抗菌肽的影响及转基因猪的研究提供了一种试验模式。
４研究展望及存在问题
抗菌肽是哺乳动物防御系统的一个重要组成坏分，具有热稳定、水溶性好、广谱杀菌甚至有的能杀真菌。原虫等优点，而且许多抗菌肽在１００℃加热１０min条件下仍能保持一定活力，且对较大的离子强度和较低或较高的州都有较强的抗性，而对其核细胞几乎无作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，并且与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机制完全不同，病源菌不易对其产生耐药性，由此显示了它具有独特的研究和应用价值。近２０年来，人们对昆虫抗菌肽已进行了比较系统的理论和应用研究，但有关畜禽抗菌肽基因工程应用研究方面的报道较少。从哺乳动物抗菌肽特有的性质，显示了它具有以下几个方面在畜牧生产上的研究和应用前景。
４．1 药用前景随着传统抗生素的广泛及长期的应用，许多病源菌对它们产生了耐药性，而具有广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研究中具明显优势。随着对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深化设计一种高效的、有利于人类健康的抗菌肽作抗生素替代品是完全可行的。
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