国家饲料质量监督检验中心（北京） 杨曙明 高 生 范 里 宋 荣
克伦特罗是β-肾上腺素激动剂（简称β-兴奋剂）的一种，从化学性质上看是苯乙醇胺的衍生物，其分子结构与肾上腺髓质等处分泌的肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等儿茶酚胺类相似。在生理上，它们能抑制糖原合成酶并激活磷酸化酶，从而加速糖原分解，提高血糖和糖代谢率；通过作用于脂肪组织，可提高激素敏感脂酶活性，加速脂肪分解，提高血液中游离脂肪酸浓度，促进其在肌肉组织中的氧化分解；增加心率、心血输出量、心缩压，提高骨骼肌、冠状动脉和肝脏等局部血流量。在动物营养上，利用它具有促进畜禽脂肪分解、增加肌肉生长作用，作为营养重分配剂应用于饲料生产中。人食用了饲喂克伦特罗这种添加剂的动物所生产的畜产品后，由于畜产品中残留的克伦特罗会引起中毒，通常会出现肌肉震颤、心悸、精神紧张、头疼、肌肉疼痛、晕眩、反胃、呕吐、发烧、发抖等症状。因此，世界许多国家禁止在饲料中使用克伦特罗来增加动物的瘦肉率。我国政府已明文规定在畜牧生产中严禁使用克伦特罗等β-兴奋剂。
目前，测定饲料中的克伦特罗的方法有高效液相色谱-质谱联用法（HPLC－MS）、气相色谱-质谱联用法（GC－MS）、高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附法（ELISA）等，通常以前两种作为确认方法，后两种作为筛选方法。农业部2001年颁布的强制性行业标准一饲料中盐酸克伦特罗测定（NY－438）包括 GC－MS和 HPLC两种方法，前者为仲裁方法。本文讨论用ELISA方法测定饲料中克伦特罗的原理、准确度和精密度，为在生产实际中应用提供参考。
1 ELISA法原理
利用免疫学抗原抗体特异性结合和酶的高效催化作用，通过化学方法将植物辣根过氧化物酶（HRP）与克伦特罗（CL）结合，形成酶偶联克伦特罗。将固相载体上已包被的抗体（羊抗兔IgG抗体）与特异性的抗克伦特罗抗体结合，然后加入待测克伦特罗和酶偶联克伦特罗，它们竞争性与克伦特罗抗体结合，洗涤后加底物，根据有色物的变化计量待测克伦特罗量。若待测克伦特罗多，则被结合的酶偶联克伦特罗少，有色物量就少。用目测法或比色法测定样品中的克伦特罗含量，比色的最佳波长为450 nm，参比波长应大于600 nm。
2 检测试剂与材料
2．l 克伦特罗酶联免疫法测试盒组成
2．1．l 包被羊抗兔IgG抗体的聚苯乙烯微量反应板，24、48或96孔。
2．1．2 克伦特罗标准溶液，6个梯度：0、100、300、900、2700、8100 mg／L。
2．1．3 酶偶联克伦特罗：CL与过氧化物酶的交联物，浓溶液，使用前需用缓冲液稀释。
2．1．4 底物液：过氧化氢邻苯二胺溶液，过氧化氢浓度为0．3 ％。
2．1．5 缓冲液：含 0．01～0．05 mol／L pH 7．5磷酸钠缓冲液（PBS），加入0．05％吐温-20、0．l％牛血清蛋白（BSA）。
2．1．6 显色剂液：用 pH 5．0乙酸钠-柠檬酸缓冲液配制0．2 g／L的四甲基联苯胺溶液。
2．1．7 终止剂：2 mol/L硫酸溶液。
2．2 其他试剂甲醇、0．L mol／L盐酸溶液、1 mol／L NaOH溶液、重蒸水。
2．3 仪器设备 酶标仪（带有450 nm滤光片）、离心机（5000 r／min）、震荡器、微量移液器（20、50、100、200μL）。
3 检测步骤
3．1 样品处理 粉碎，过40目筛；准确称取样品1 g（准确至0．0001 g），放入离心管中（15 mL），加入 1 mL 0．mol／L稀盐酸，混匀，加入 9 mL重蒸i水，混匀，置超声波中20 min，离心（2000 r／min）20min，取上清液0．5 mL置于15 ML离心管中，用 1 mol／L NaOH凋 pH 7～9，加入 9．5 mL重蒸水，混匀，离心（2000 r／min）20 min，取上清液2 mL置于10 mL试管中，加入3 mL重蒸水，混匀，上酶标板测定。
3．2 限量测定 准备包被抗体的聚苯乙烯微量反应板，根据待测样品数量和标准样品（每个样品2个重复），决定微孔的使用量。将微孔从冰箱中取出，放在室温下（25±4℃）回温10～30min。每个微孔中加入 100μL CL的抗体，室温下培养15min，将微孔中液体垂直倒掉后在滤纸上用力垂直磕掉残留在壁上的液体3次以上，加入250 μL蒸馏水，垂直倒掉洗涤微孔液体，再重复2次以上，每个微孔加入20 μL标准溶液或待测样液，然后每个微孔加入100 μL酶标记抗原，在室温下培养30 min，每个微孔加入50 μL底物和 50 μL显色剂，混合后在暗室中培养15min，然后每个微孔加入100 μL终止液。
3．3 结果判定
3．3．l 目测法：先比较阴性对照和阳性对照孔的颜色，两者颜色应有明显差异，前者深后者浅。如果待测样品的颜色与阳性对照孔接近或更深，则判定该样品不含CL；如果待测样品比阴性对照孔浅，比限量孔深，则判定该样品含有CL，但浓度低于限量；如果待测样品比阳性对照浅，则判定该样品含有CL 且浓度高于限量；如果待测样品和阳性对照相同或接近，则判定该样品含有CL，且浓度等于限量。
3．3．2 仪器法用酶标定仪，在450 nm处用空气做参比调零点后测定标准孔及试样孔吸光度A值。A阴性对照与A阳性对照．间差值至少大于0．2；若A待测样品≥A阴性对照，则判定该样品不含CL；若A＞阴性对照＞A待测对照A＞A阴性对照则判定该样品含有CL，但浓度低于限量；A待测样品＜A阳性对照，则判定该样品含有CL且浓度高于限量；A待测样品=A阳性对照，则判定该样品含有CL 且浓度等于限量。
3．4 定量测定 将6个梯度的克伦特罗标准溶液（0、100、300、900、2700、8100 ng／L）按限量法测定步骤测定得相应的吸光度值。以0浓度AO值为分母，其他标准浓度的A值为分子的比值，再乘以100，获得吸光度的百分比。以此吸光度百分比为纵坐标，对应的5个CL标准浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。该定标模型在200～2000ng／kg范围内是线性的。
待测样品根据其吸光度，在曲线中获得CL量，再根据式（1）计算出样品中CL含量。
X=rVN／m……………………………… （1）
式中：X：样品中CL含量，μg／kg；
r：从标准曲线上查得的试样提取液中CL含量，ng／kg；
V：试样提取液体积，mL；
N：试样稀释倍数；
m：试样的质量，g。
4 该方法的准确度和精密度测定
回收率和重现性试验结果（见表1和表2）显示，饲料中 CL浓度为0．5、1．0、3．0 mg／L时，该方法的回收率分别为 112．2％、87．8％和90．4％；8次测定的变异系数分别为9．09％、7．00％和9．29％。
表1 方法回收率试验结果
|
样品含量 |
基础样品 |
添加量（mg/kg） |
回收量（mg/kg） |
回收率（％） |
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M |
阴性 |
0.5（N=5） |
0.561±0.08 |
112.2 |
|
M |
阴性 |
1.0（N=5） |
0.439±0.05 |
87.8
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