维生素D在动物骨骼组织矿化代谢过程中起着十分重要的作用,它不仅促进钙与磷在肠道的吸收,而且也作用于骨骼组织,促进钙磷最终形成骨质的基本结构,当维生素D缺乏时会导致动物患佝偻病和软骨病等。饲料预混剂中通常加入适量维生素D等作为营养强化剂,其含量的多少直接影响着预混剂的质量。近年来随着高效液相色谱技术的快速发展,已被广泛应用于食品及饲料成分分析领域。对于高效液相色谱分析预混剂中的维生素D,国家尚未定出标准,笔者就测定过程中的提取(皂化)探索了方法的准确度,就精密度做了重现性研究,建立了一种快速准确的测定方法。
1 仪器、试剂及色谱条件
主要仪器:高效液相色谱仪M209型(日本沃特斯公司产品),主要部件有M490紫外检测器、M740数据处理机、U6K自动进样器、M510泵2台;美国产Foxy-200型HPLC制备仪。
主要试剂:VD3(德国Merck公司产品),其余试剂均为国产(分析纯)。
色谱条件:C18,5 μm,3.9 mm×300 mm。
流动相:甲醇∶异丙醇∶1 mol/L醋酸盐缓冲液=50∶45∶5(甲醇为紫外光谱纯,水为二次蒸馏水)。
紫外检测波长λ=254 nm,Aufs=0.04。
流速:1 mL/min。
2 标准品及标准色谱图
将德国Merck产品VD3配成15 %的甲醇溶液,用Foxy-200型HPLC制备仪制备,馏分置五氧化二磷干燥器中减压干燥至恒重备用,用反相色谱法测定纯品含量为99.9999 %(归一法)。准确称取VD3 5 mg,用50 mL(以流动相作溶剂)溶剂溶于100 mL容量瓶中并定容,稀释至每毫升含VD3 5 μg作为标准储备液,用此标准储备液进样20 μL,得一标准色谱图,保留时间为8.095 min。
3 线性范围
用上述流动相作为溶剂,稀释标准储备液使每毫升含VD3 3.0、2.5、2.0、1.0和0.5 μg,分别进样20 μL,以浓度为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,得出不经过原点的回归方程:
y=4.24×106C+0.0629×106, r=1。
VD3在0.5~3.0μg浓度范围内线性关系良好。
4 回收率试验
准确称取某饲料公司供作预混剂基料的玉米芯粉0.5 g共5份,分别加入制备后得到的VD3纯品3 mg,强力搅拌均匀,按样品提取方法提取,用异丙醇稀释提取物至每毫升含2.5 μg左右,用0.45 μm膜过滤后进样20 μL,M740数据处理机用二点外标法给出数据,根据提取稀释倍数计算出含量,回收率为98.3 %,见表1。
表1 VD3回收率试验数据 n=5
加入量(mg/dg) | 测出量(mg/dg) |
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