杨晓建　陈建新

1　所用仪器设备和试剂的注意事项

1.1　色谱柱的尺寸为：内径12.5 mm×长30 cm，带活塞。测定所用色谱柱如果内径过大，则吸附剂和洗脱液消耗量均多；内径太小，则单位长度内柱中吸附剂的量减少，对叶黄素的吸附容量随之下降。同时活塞上不需涂润滑剂。如果涂上凡士林等润滑剂，则有可能因润滑剂溶于洗脱液而干扰比色测定。此外色谱柱和承接洗脱液的刻度管或容量瓶，应该是干燥无水的。
1.2　吸附剂氧化镁与疏松剂硅藻土的混合比例为1∶1。为确保二者混合均匀，须机械混合30 min以上。混匀后，105 ℃烘24 h即被活化，亦可在200 ℃下烘5 h快速活化。活化后放入干燥器内储存，如存放一段时间后再使用时，应再活化。无水硫酸钠在临用前，须105 ℃以上温度烘5 h以上，以除去吸附的水。
1.3　从市场购买作为参比标准的苏丹Ⅰ，须用热无水乙醇重结晶。重结晶过程中的第一次过滤应趁热，否则得率低。第二次过滤所得结晶在70 ℃下烘干至恒重，最好真空干燥。重结晶所得苏丹Ⅰ，避光存放于干燥器中。苏丹Ⅰ储备液配制时，重量和所用溶剂比例一定要严格遵守，即0.124 g苏丹Ⅰ溶于500 mL丙酮+异丙醇(1+1)的混合溶剂中。工作液亦须用1∶1的丙酮+异丙酮混合溶剂配制。苏丹Ⅰ的储备液和工作液，均应密封存放在暗处。建议苏丹Ⅰ工作液每月配制一次。
1.4　试剂均应是分析纯或分析纯以上的纯度。

2　操作过程中的注意事项

2.1　样品粉碎至少过40目筛，最好过60目筛。
2.2　热皂化适用于快速提取或含叶黄素酯类高的样品。热皂化的水浴温度，应恒定在56 ℃ 20 min。因丙酮沸点是56.5 ℃，所以超过此温度则丙酮会挥发，故还须在皂化瓶口处接一冷却装置进行冷却。据我们的经验，在瓶口处接一根较长的玻璃空管冷却，即可获得满意的效果。同时我们发现测定常用饲料中叶黄素含量时，热皂化与冷皂化的效果相当，测定结果基本一致。
2.3　填装色谱柱时，松紧应适宜，填充太紧则洗脱困难。吸附剂填充约6～8 cm高，压平吸附剂顶部，其上再装2 cm高的无水硫酸钠。当空气中湿度较大时，常会遇到洗脱所得叶黄素溶液有明显分层现象，下层的黄色比上层更深，使测定结果偏低，在潮湿季节这种现象尤为严重。我们发现这是由于洗脱液中的甲醇极易吸收空气中的水分，导致丙酮、甲醇和水互溶而与正己烷分层，相当一部分叶黄素溶于极性层。为解决这一问题，可在色谱柱上再接一只约10 cm长的无水硫酸钠柱，洗脱液先经此柱去水后再流入色谱柱，这样处理后便不再出现分层现象。或用乙醇代替甲醇制洗脱液，也可克服分层现象。
2.4　移取上层液入色谱柱时，不要吸到下层的水相，否则严重影响测定结果。洗脱所得叶黄素溶液应避光放置并尽快(2 h以内)比色，以免被空气氧化或异构化。同时应使溶液吸光度在0.25～0.75范围，以提高测定准确度，这可通过控制上柱试液体积和稀释倍数来实现。有时比色皿中的叶黄素溶液会出现白色细状物从上往下飘，使吸光度读数不稳定。经多次观察，我们发现是由于操作者的手污染比色皿顶部边沿所致。
2.5　分光光度计应先用苏丹Ⅰ工作液在469～479 nm间以1 nm间隔进行校正，观测最大吸收是否在474 nm处，否则须重校仪器。当然如果有可以连续进行光谱扫描功能的分光光度计，可以直接在此波长区域内扫描，观测其光谱最大吸收峰是否在474 nm。苏丹Ⅰ工作液(0.04 mmol/L)在474 nm处吸光度为0.561，我们对苏丹Ⅰ工作液多次实际测得值偏离该值的幅度不会超过10 %。每次进行测定时，用苏丹Ⅰ工作液校正分光光度计。
2.6　试样的提取和色谱分离均需消耗大量挥发性有机溶剂，均有一定毒性，其中甲醇和甲苯毒性较大，危害操作者身体健康，因此操作者应戴防毒口罩，最好在通风橱内进行操作。