动物转基因技术主要应用于动物改良、培育新品种；制造具有生物活性的产品，包括器官移植和生物反应器；建立疾病模型、基因治疗和发育调控等。目前，转基因小鼠、大鼠、牛、羊、猪、兔、鸡、鱼等均已获得成功。转基因的迅猛发展，使不少科学家认为转基因研究可望在短期内改变动物的生产性状。然而，近年来的研究表明，转基因动物的研究还存在不少问题亟待解决，如制作转基因动物的效率很低，难以控制转基因在宿主基因组的整合，转基因表达水平低等。本文拟对近年来发展起来的新的转基因方法及技术路线，转基因的整合与表达特点及提高转基因表达水平的策略作一综述。
1 转基因新方法
1．1 核移植法转基因 1997年，世界上第一只体细胞克隆羊多莉（Dolly）在英国罗斯林研究所诞生，不久该研究所又与英国PPL公司合作诞生了世界上第一批转基因绵羊保莉（Polly）（SchniekeAE等，1997），这些绵羊的细胞不仅含有1个标记基因，而且还带有人类凝血因子IX基因。研究者用人凝血因子IX基因和新霉素抗性基因共同转导绵羊胎儿成纤维细胞，之后用C418筛选出的细胞必然整合了新霉素抗性基因，其中部分细胞可能同时整合了人凝血因子IX基因。然后通过DNA杂交的方法鉴定其中同时整合了上述2种基因的细胞。研究者以上述2个整合基因的绵羊胎儿成纤维细胞作核供体，获得了3只转基因绵羊（其中1只出生后不久死去）。Gibelli等（1998）通过体细胞核移植技术制作了3头含外源标记基因（LacZ）的犊牛，所使用的核供体细胞也是胎儿成纤维细胞。Alexander等（1999）通过体细胞核移植技术获得了3只转人抗胰蛋白酶（hAT）基因的奶山羊。出生的后代100％为转基因个体，虽然胎儿的死亡率高，但其得到转基因动物的总效率高于原核显微注射法。此外，由于在核移植前可以选择后代的性别，一旦产生转基因后代，其遗传背景及遗传稳定性一致，不需选配，仅一代就可建立转基因群体，节约时间和费用。
1．2 受体介导的基因转移 早期胚胎中有胰岛素及胰岛素样生长因子IGFI和IGFll表达，外源性胰岛素促进细胞增殖及胚胎形态发生；而且早期胚胎细胞内存在胰岛素受体，使受体介导的基因转移成为可能（刘薇等，2001）。1999年，IvanvaM．M构建了1个同时携有胰岛素-多聚赖氨酸及DNA的构建体，其构建方法是用交连剂N-琥珀酸3-（2-吡哆二巯基）丙酸将胰岛素和多聚赖氨酸连成聚合体，以 SephacrylS-300纯化后与DNA连接。将兔与鼠的胚胎与该构建体共培养3h，显微镜观察证实：该构建体穿过了透明带在卵裂球核旁区聚集；原核和2-细胞胚与构建体共培养后胚泡形成率为 70％；印记杂交显示 12 d及15 d鼠胚和一个新生鼠基因组内均有外源DNA的整合；并且构建体中加上腺病毒能促进外源基因在早期胚胎内的保留和表达。该试验结果证实了受体介导外源基因进入早期哺乳动物的可行性。
早期胚胎转化中最严重的一个问题是试验中所用成分对胚胎的损伤或毒性。本试验采用胰岛素作为介入体，该法加优点是不需显微操作，而且使用的运载工具对胚胎无明显毒害作用，因此可为将来的基因治疗提供一条新途径。
1.3 逆转入病毒载体注射MII期的卵母细胞可以认为这一方法是对逆转入病毒感染早期的动物胚胎方法的1种改进（刘建忠等，2000）。Anthony等（1998）认为以逆转入病毒载体介导的基因整合的关键在于有丝分裂时出现的核膜分裂，细胞分裂完后很快重新形成。处于减数分裂MII期的卵母细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂M期的细胞，这为逆转入病毒载体介导的基因插入提供了更大的可能性。研究者将乙肝表面抗原基因插入复制子缺失的逆转入病毒载体内并以之注射MII期的牛卵母细胞。注射完毕后的卵母细胞同获能后的牛精子共同孵育24 h使其受精并在体外进一步培养。在经逆转入病毒载体注射和体外受精处理的836个卵母细胞中，有174个在体外发育到囊胚期，将其中的10个胚胎移植到5头受体母牛的子宫内，3头怀孕并生出4头健康犊牛（2公2母）。进一步的研究结果表明，4
头牛的皮肤和血液中都携带乙肝表面抗原基因，2头母牛的乳汁中含有乙肝表面抗原。转基因公母畜的遗传都很稳定且遵循孟德尔遗传，展现出良好的应用前景。
1．4 卵母细胞胞质内显微注射法 将精子与外源基因共同孵育，然后通过人工授精制作转基因动物的精子载体法曾引起科学家的注意。但此法重复率低、结果不稳定。Anthong等（1999）报道了1种新的方法即首先将精子与外源基因共孵育lmin，然后将精子的头部显微注入MII期的小鼠卵母细胞，在出生的后代中转基因阳性率可达20％以上，而且精子膜破损更有益于转基因动物的获得。这种方法与精子载体法的明显差别在于，一个是显微注射，一个是人工授精。操作程序前者比后者复杂的多。用卵母细胞胞质内注射法制备转基因哺乳动物使用的微注射针较原核显微注射针口径大100倍，能处理较大的基因构建，如酵母或哺乳动物人工染色体。转基因与精子头部结合兆碱基（106）及亚兆碱基级的基因构建可稳定结合。这些较大的构建含有表达所需的调控序列，能大大提高外源基因的整合及表达水平。对大型动物如牛、猪等而言，其合于是不透明的，原核显微注射较为困难，而用该法可克服此缺陷。这些特性使该法具有广泛的实用性。
2 外源基因的整合和表达
2．1 外源基因的整合 外源基因的整合受很多因素包括DNA的构型、进入宿主细胞的方式、DNA的浓度等的影响，其特点为：①l～100拷贝的外源基因以头尾成串的方式整合到宿主细胞的染色体上，一般为单位点整合，有时在不同染色体的不同位点整合；②整合基因导入方法的不同，外源基因的整合分为随机整合与定点整合；③整合一般具有稳定性，大部分以孟德尔方式遗传后代，少部分嵌合体，极少转基因未整合到染色体上，而是以附加体形式存在，并可传至后代；④目前认为基因表达的强弱与整合的拷贝数无关，而与整合位置有关；⑤原核生物的载体序列可能会抑制某些基因的表达；⑥少数基因位点的侧翼序列有重排现象，或基因部分整合情况；⑦外源基因插入常出现宿主基因序列的重排、缺失、重复或异位；⑧转基因可能会造成宿主细胞基因突变出现新表现型，有时会影响管家基因以至发育致死（金鹰等，2000）。
2．2 外源基因整合的不同方式 由于采用转基因的方法不同，外源 DNA导入宿主细胞的整合机制也不同，几种机制的性质和效果也各有特色（Zhou TQ等，1994）（见表1）。
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不正常重组 |
同源重组 |
逆转录病毒整合 | |||||
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概率 |
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