王兰芳，乐国伟  (无锡轻工大学饲料研究所,江苏   无锡  214036)
      中图分类号:S852.2  文献标识码:B   文章编号:1008-9381(2001)03-0015-02

    mRNA差显技术(different display reverse transcription PCR,DDRT-PCR)是近年来应用较为广泛的技术，是由Liang和Pardee于1992年以研究与癌症有关的基因为目的，创立的一种鉴定与克隆哺乳动物正常生理状态与异常状态细胞之间差异表达的基因的方法。目前该方法己经应用于动植物及人类营养调控、疾病发生(Utans,1994)、生长发育(Zimmermann,1994)等有关的基因的鉴定与克隆。本文就mRNA差异显示技术的原理、优缺点，以及在营养调控研究等方面的研究加以综述。

    1  mRNA差异显示技术的原理

    真核细胞mRNA3'端有一个由30～300个腺苷酸连成的多聚腺苷酸(polyA)尾巴，与3'端相邻的两个碱基之间只有12种组合，即GG、GC、GT、GA、TG、TC、TA、TT、CG、CC、CA、CT。从实验样品中抽提总RNA或mRNA，选取T l2 MN(M=A/G/C,N=A/G/C/T)作为3'锚定引物，在逆转录酶作用下可启动mRNA的反转录，合成第一链cDNA。以该cDNA为模板，如人TaqDNA聚合酶、dNTP、5'和3'端引物进行PCR扩增。将扩增后的样品用变性或非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，曝光后就可以观察到有差异表达的mRNA的DNA扩增条带。将有差异表达的片段回收，用相同的引物进行PCR二次扩增纯化，以增加差异条带的量。将PCR二次扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，分离并纯化不同的差异条带。取部分差异cDNA片段放射性标识后作探针，与总RNA作Northern杂交、斑点杂交以排除假阳性片段。同时将获得的差异片段进行克隆、测序，并与基因序列数据库中的序列作同源此较，如果所获得的差异片段是新的基因片段，可以申请登记入库。

    2  mRNA差异显示技术的优越性及缺陷

    研究基因差异表达的方法有多种，主要有双向蛋白电泳指纹图谱和差减杂交技术。与减法杂交等常规技术相比，DDRT-PCR具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时比较多种给定生理状态或不同发育阶段的细胞内mRNA样品等的优越性。具体表现在: ①该技术的操作简单，如逆转录，PCR扩增等都是分子生吻学常用技术；②仅需要2Oμg的mRNA，可以同时分析多组样品，敏感性高，可检出低丰度mRNA，而差减技术至少需要200μg的mRNA; ③DDRT-PCR技术可以在两天内检测到差异片段，整个实验周期短，约一周即可完成扩增和Northern杂交，在实验的过程中可以步步验证、比较，而不象其他方法需要到最后才知道。

    然而该技术尚存在一些缺陷;主要表现为: ①特异性差异片段的假阳性率高，有时甚至高达85%。主要有三个方面的原因:一是总RNA虽经Dnase I处理，但仍有少量的DDNA污染;二是序列胶中显示的一条特异cDNA带中可能含有放射性自显影所检测不到的重叠带;三是有些特异cDNA片段太短，在Northern杂交时检测不到杂交信号，误认为是假阳性。②有放射性污染。③cDNA扩增产物的量不仅取决于mRNA的丰度，而且也取决于引物与其相匹配的程度。即使是高丰度的mRNA，也会因为引物设计的不合理而导致扩增产物的量少于低丰度但与引物匹配较好的mRNA的扩增量。

    以上的缺陷使得差异显示技术的应用受到一定限制，因此该技术自创建以来，学者们不断的对其进行改进，主要从引物的设计、PCR循环参数、假阳性鉴定、防止放射性污染等方面进行改进(Bauer,1993;Callard,1994),优化引物的设计和PCR循环参数，使得引物和PCR循环条件逐渐接近标准的PCR反应，使产物的鉴定更为方便、快速、准确。为了避免放射性污染，研究人员采用银染、荧光染色等方法代替传统的放射性标识，也取得了较好的效果(Lobmann，1995;D0ss,1996;孟祥文1997)。

    3 mRNA差异显示技术在营养学中的应用

    近几年来许多研究表明营养物质的作用与基因调控有关，当某种营养素的缺乏或过多时，在分子水平上就表现为某个或某些基因表达的开启、关闭或表达量的变化。铜在营养学中的重要作用已为人们所知，为了从分子水平探讨Cu的作用，Wang(1996)利用mRNA差异显示技术对缺铜6周的雄性Sprague Dauley大鼠肝脏mRNA与正常大鼠肝脏mRNA进行了比较，发现有1O个cDNA片段差异表达，其中一个在铜缺乏大民肝脏组织中的表达三是对照组的1.2倍，对该片段进行克隆测序，查询发现该基因是一新的未知基因，研究还发现在缺铜大鼠肝脏中有,4种已知基因、5种未知基因有表达差异，4种已知基因分别是:大鼠铁蛋白;大鼠胎球蛋白;大鼠线粒体12SrRNA和l6SrRNA、苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸tRNA基因和大鼠16SrRNA、高氨酸tRNA和缬氨酸tRNA线粒全基因。结果提示铁蛋白是一种应激蛋白，与铜缺乏密切相关。

    已知视黄酸在中枢神经系统、皮肤及骨骼等组织器官的生长、分化等过程中起着非常重要的作用。为了研究在软骨形成中对视黄酸(RA)敏感基因的mRNA的表达，Dietz(1996)对经视黄酸诱导的牛软骨细胞和未经诱导的细胞进行DDTR-PCR分析。结果发现有6个mRNA的表达量在（RA）诱导敏感，因而称该蛋白为视黄酸敏感软骨蛋白(cartilage-de-rived retinoic acid-sensitive protein,CD-RAP)。White(1996)，利用差异显示技术分析了斑马鱼体内由外源维生素A引起的差异表达基因，结果分离到一个编码细胞色素P450新成员的克瞳-P45O RAl。P45ORAl是在分子水平分离鉴定的参与视黄酸代谢的第一个酶组分，为深入研究RA代谢奠定了基础。Reddy(1996)利用差异显示技术对培养的猴气管细胞维生素A应答基因进行了分析，发现其中一个差异表达基因的cDNA序列与人体核仁素基因有90%的同源性。

    Fritsche (1997)将新鲜人血单核细胞用维生素D2诱导4h后，用差异显示技术对其进行分析,分离到一个cDNA片段，Northern分析发现该片段在单核细胞中低表达，当加入维生素D3时，其表达水平上升。Xu(1997)对维生素D3缺乏与正常的鸡肾脏和小肠组织进行了分析，发现一个差异表达片段在肾脏中有差异表达，并对维生素D3有下调作用，研究提示该cDNA片段具有组织特异性(仅表达于肾脏)。

    4  mRNA差异且示技术的应用前打展

    传统的营养学研究大多局限于营养物质对动物的功能性研究，而对其作用机理的研究并不深入，在机理研究方面缺乏新的更好的方法。在科技迅速发展的今天，分子生物学技术己经成为人们认识各种生命现象，揭示生命本质的一种重要的手段。DDRT-PCR技术正是在此情况下产生的，它能够将所有与营养物质调控有关的基因显示出来，拓宽了研究人员的研究范围。相信该技术将在阐明营养物质询控机理和营养缺乏病的分子基础，寻找营养相关基因等方面发挥更大的作用。