许梓荣，胡彩虹，李卫芬
        （浙江大学饲料科学研究所，杭州  310029）

    摘要：钙蛋白酶广泛存在于各组织，广泛表达的钙蛋白酶有两种，钙蛋白酶Ⅰ和钙蛋白酶Ⅱ，它们激活所需的Ca2+浓度不同。新近还发现了几种组织特异表达的钙蛋白酶（n-钙蛋白酶）。钙蛋白酶抑制蛋白是钙蛋白酶的内源抑制蛋白。胞内钙蛋白酶的活性受钙蛋白酶抑制蛋白和Ca2+的调节，但具体过程还不清楚。大量研究表明钙蛋白酶系统可使完整的肌原纤维解装配成肌丝或多肽片段，从而引发占横纹肌大部分的肌原纤维蛋白质的降解。本文还讨论了影响骨骼肌钙蛋白酶系统的因素，包括动物的年龄，去势，营养水平，β--兴奋剂和遗传因素。

    骨骼肌生长速度最终取决于三个因素：骨骼肌细胞的数量、肌肉蛋白合成速度和降解速度。激素注射、营养状况和饲养管理等都能通过调节以上三个基本因素中的一个、两个或三个而影响肌肉生长速度。骨骼肌蛋白降解速度相对降低会导致肌肉生长速度的增加，也会提高摄入营养物质的肌肉转化效率。骨骼肌蛋白降解的途径主要有三条：溶酶体组织蛋白酶途径、依赖钙的钙蛋白酶途径和依赖ATP的遍在蛋白质途径。肌原纤维蛋白占成熟骨骼肌蛋白总量的50％～60％。哺乳动物骨骼肌肌原纤维呈圆柱状，直接1～3μm，长1～40mm，而溶酶体或胞质蛋白酶的直径约16urn，长约11mm，因此肌原纤维不能进入溶酶体。因此，肌原纤维蛋白质降解的第一步是肌原纤维解装配成肌丝，这一步可能是肌原纤维蛋白质降解过程中限速的一步。大量的研究表明钙蛋白酶系统参与这一解装配过程。

1  钙蛋白酶系统的结构及活性调节

    第一次发现钙激活中性蛋白酶（简称钙蛋白酶）至今已有20多年的历史。在体内，通过Ca  2+激活及自溶而表现出蛋白水解酶的活性，并通过钙蛋白酶抑制蛋白抑制活化的钙蛋白酶。钙蛋白酶系统主要作用对象是细胞骨架蛋白，蛋白激酶和磷酸酶以及激素受体。

1.1 钙蛋白酶结构  广泛存在的钙蛋白酶有两种，钙蛋白酶Ⅰ（又称μ-钙蛋白酶）和钙蛋白酶Ⅱ（又称m-钙蛋白酶），都由两个亚基组成，分子量相近，但两者表现半最高活性所需的Ca2+浓度不同，μ-钙蛋白酶所需的Ca2+为1～12μ moL/L，而m-钙蛋白酶为250～750μ moL/L。它们的小亚基相同，而大亚基是两个相关基因的产物，两种大亚基之间存在一定的免疫交叉反应。

    目前，兔、牛及人的钙蛋白酶大小亚基的cDNA已克隆，鸡钙蛋白酶大亚基的cDNA已克隆。不同来源的钙蛋白酶cDNA序列发现其大亚基由四个结构域组成，其中结构域Ⅱ是表现水解活性的关键部位，它约占大亚基氨基酸残数的35％左右；结构域Ⅳ，位于羧基端，占氨基酸残基数的20％，是钙离子结合部位，与其它钙结合蛋白如钙调素蛋白（CaM）有明显的相似性，含有四个EF-手结构；结构域Ⅰ和结构域Ⅲ，分别占氨基酸残基数的10％和35％，可能起活性调节作用。小亚基合两个结构域，结构域Ⅱ和大亚基的结构域Ⅳ很相似，类似于CaM，也有四个EF-手结构。除了上述广泛存在的钙蛋白酶外，新近又发现了组织特异性表达钙蛋白酶（又称n-钙蛋白酶）。第一个发现的特异表达钙蛋白酶，比其他钙蛋白酶多三个片段，在肌肉中特异表达。

1.2  钙蛋白酶抑制蛋白的结构  钙蛋白酶抑制蛋白是胞内专一性抑制钙蛋白酶活性的蛋白质，它可以识别钙蛋白酶与钙结合引起的构象变化并与之特异结合。兔和猪的钙蛋白酶抑制蛋白cDNA首先被克隆。比较不同哺乳动物钙蛋白酶抑制蛋白cDNA序列发现，它们的保守性较差。该蛋白含五个结构域，第一个结构域的功能还不太清楚，第二到五个结构域是四个结构相似的重复单位，每个重复单位含三个保守区，分别为A、B、C。保守区B约含30个氨基酸，其中由Thr-Ile-Pro-X-Tyr-Arg组成的七肽序列十分保守，它可能是钙蛋白酶抑制蛋白起抑制作用的关键部位。通过基因重组，使钙蛋白酶抑制蛋白cDNA片段在大肠杆菌中表达，发现含此保守序列的多肽片段，即使少到30～70个氨基酸残基也能抑制钙蛋白酶活性。保守区A和C决定着钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶中CaM类似结构域的结合。

1.3  钙蛋白酶活性的调节  细胞中钙蛋白酶活性受到Ca3+和钙蛋白酶抑制蛋白的调节。提高Ca2+浓度，钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶结合，这可能起到防止钙蛋白酶被随机激活的作用，Ca2+浓度进一步提高将导致构象变化而表现蛋白水解酶活性。当钙蛋白酶被Ca2+激活后，如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在，将迅速与之结合，而抑制蛋白酶活性，从而保证钙蛋白酶对底物只进行局部的特定位点的水解。

    由于激活钙蛋白酶所需的ca2+浓度大于1μ mol／L，而胞内的ca2+为0.2～0.8μ mol／L，不足以激活钙蛋白酶。在活体中，钙蛋白酶如何被激活一直是一个令人困惑的问题。因此，当发现磷酯酰丝氨酸和磷酯酸肌醇能降低钙蛋白酶所需要的ca2+浓度时，人们便设想细胞膜对该酶有激活作用。尽管磷脂能降低钙蛋白酶激活所需的ca2+浓度，但这与细胞内ca2+浓度还存在较大的差异。这样，就使人们推测是否存在活化蛋白，它与钙蛋白酶结合可以大为降低钙蛋白酶活化所需的ca2+浓度。这种活化蛋白可能是一种激酶，它使钙蛋白酶分子的特定位点磷酸化而使钙蛋白酶对ca2+的亲合力提高，也可能通过与钙蛋白酶结合而起活化作用。而活化蛋白本身受磷酸化和去磷酸化的调节。尽管有钙蛋白酶活化蛋白被分离的报道，但目前对这种活化蛋白的了解还很少。

2  钙蛋白酶系统在骨骼肌生长中的作用

    骨骼肌钙蛋白酶存在于肌细胞内部，在Z线中浓度最高。快速萎缩肌肉钙蛋白酶活性是正常的数倍，它的一个特征是Z线的降解，而肌动蛋白和肌球蛋白保持完整。体外试验表明，肌原纤维用纯μ-或m-钙蛋白酶并在ca2+存在下培养，Z线完全消失，肌原纤维释放出肌丝，在钙蛋白酶抑制剂存在下，释放出的肌始比率下降。

    哺乳动物骨骼肌肌原纤维呈圆柱状，直径1～3μm，高1～40mm，而溶酶体或胞质蛋白酶的直径约16nm，高约11nm。因此，肌原纤维蛋白质降解的第一步是肌原纤维解装配成肌丝。大量研究表明，钙蛋白系统参与这一解装配过程。钙蛋白酶引发肌原纤维蛋白质降解的可能机制如下：钙蛋白酶使Z线（使细肌丝固着手肌原纤维）和肌联蛋白、伴肌动蛋白（使粗肌丝和细肌丝固着于肌原纤维）降解，肌原纤维释放出肌丝。细肌丝的肌原蛋白和原肌球蛋白以及粗肌丝的C-蛋白降解，粗肌丝和细肌丝分别解离出肌球蛋白和肌动蛋白。释放出的粗肌丝和细肌丝可与母体或其他肌原纤维重新装配，也可被胞质蛋白酶或溶酶体组织蛋白酶降解成氨基酸。肌原纤维的残留部分功能完整，收缩力量减弱。

3  影响骨骼肌钙蛋白酶系统的因素

3.1  年龄  体重20kg左右的绵羊股二头肌钙蛋白酶Ⅰ，钙蛋白酶Ⅱ和钙蛋白酶抑制蛋白的活性均显著低于刚出生羔羊，但与体重约60kg的上市绵羊相比均无显著差异。20月龄牛与犊牛相比，钙蛋白酶Ⅰ和钙蛋白酶抑制蛋白活性显著下降，钙蛋白酶Ⅱ活性显著上升。体重90kg猪与20kg猪相比，钙蛋白酶Ⅰ活性显著升高。钙蛋白酶Ⅱ和钙蛋白酶抑制蛋白活性显著下降。兔骨骼肌钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白活性随年龄增大而下降，但Nakamura等（1988）报道，兔骨骼肌钙蛋白酶抑制蛋白活性不随年龄变化。

3.2  去势  Bor-RUng等报道，公羊和阉公羊股二头肌蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白活性无显著差异，因此他们认为去势并不是通过改变钙蛋白酶系统活性而影响肌肉生长。但Morgan等报道，公牛背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白活性阀公牛显著升高，肌肉蛋白质降解速度显著降低，从而具有更快的生长速度和更高的瘦肉率。

3.3  营养水平  营养水平对钙蛋白酶系统的影响报道不一。羔羊饲喂高于其维持需要的营养对其钙蛋白酶系统没有影响；限制采食使羔羊μ-钙蛋白酶／钙蛋白酶抑制蛋白活性显著升高，从而后肢蛋白质降解速度显著升高；然而禁食使断奶羔羊μ-钙蛋白酶／钙蛋白酶抑制蛋白活性显著降低，但后肢蛋白质降解速度仍显著升高。Thomson等报道，营养水平对断奶阉公羊骨骼肌钙蛋白系统活性均无影响，但肌肉蛋白质沉积速度与钙蛋白酶抑制蛋白活性呈正相关，肌肉蛋白质降解速度与μ-钙蛋白酶活性呈负相关。禁食使兔肌肉蛋白降解增加2倍，钙蛋白酶Ⅰ，钙蛋白酶Ⅱ和钙蛋白酶抑制蛋白mRNA水平分别增加4.2倍，4.5倍和3.2倍，但活性均无变化。阉公猪饲喂无蛋白日粮14天，其背最长肌和咬肌钙蛋白系统活性均无变化。

3.4  β兴奋剂 β-兴奋剂会增加肌肉生长速度，并伴随着钙蛋白酶抑制蛋白活性和mRNA水平的显著增加。这一现象表明钙蛋白酶抑制蛋白的增加会导致钙蛋白酶抑制作用的增加和较少的肌肉蛋白更新。但是，由于肌肉细胞内已含有足够量的能完全抑制钙蛋白酶的钙蛋白酶抑制蛋白，因而β-兴奋剂所诱导的钙蛋白酶抑制蛋白的增加一定是伴随着钙蛋白酶／钙蛋白酶抑制蛋白间相互作用的改变。

        β-兴奋剂影响钙蛋白酶系统的可能机制如下：β-兴奋剂与β受体结合，使与受体偶联的G蛋白活化，进而激活腺苷酸环化酶，提高cAMP含量，再激活依赖。cAMP的蛋白激酶。cAMP使钙蛋白酶抑制蛋白启动子活性增加了5～20倍，依赖cAMP的蛋白激酶的活化增加了钙蛋白酶抑制蛋白基因的转录以及钙蛋白酶抑制蛋白的磷酶化。

3.5 品种和遗传  日本鹌鹑不同体重系（LL：高体重系；SS：低体重系；RR：对照）中低体重系肌原纤维蛋白质降解速度最高；骨骼肌m--钙蛋白酶活性的顺序为SS＞RR＞LL，但m-钙蛋白酶mRNA水平的顺序为LL＞RR＞SS，m-钙蛋白酶含量无显著差异，因此骨骼肌钙蛋白酶